DOC- 2/DAB 2结合蛋白、caspase8在皮肤基底细胞癌中的表达及作用机制

梁静，赵红丹，高福莲，李晋雪

新乡医学院第三附属医院1皮肤科，2肿瘤科，河南 新乡 453000

3新乡医学院基础医学院，河南 新乡 453000

皮肤基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC） 好发于人体头面部，是最常见的恶性肿瘤之一。中国BCC发病率较低，每年约1.1/10万，受人们生活习惯的影响，近年来BCC的发病率逐渐上升。早期BCC可表现为隆起、丘疹、结节或斑块，影响美观，虽然远处转移率较低，但会对患者造成一定困扰，部分晚期BCC患者易发生侵袭和转移，但目前BCC的发病机制尚不明确。细胞凋亡是一种受基因调控的自主死亡方式，逃避凋亡是肿瘤形成的重要原因之一。caspase 8可对机体细胞多个生物学活动进行调节，其中最主要的功能就是调节细胞凋亡。既往研究表明，caspase 8不仅可对细胞程序性凋亡及坏死性凋亡过程进行调控，还可以通过调节一系列基因的表达来调控细胞黏附、迁移等过程，在抑制肿瘤形成中发挥重要作用。DOC-2/DAB2结合蛋白（DOC-2/DAB2 interacting protein，DAB2IP）是大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）-鸟苷三磷酸酶激活蛋白家族成员之一。DAB2IP最显著的特征在于其特有的RASGAP同源结构域可以特异性调节RAS介导的一系列信号转导通路；同时，DAB2IP的C2结构域也可以通过与凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）结合，从而发挥促凋亡作用，因此，DAB2IP又被称为ASK1结合蛋白（ASK1-interacting protein 1，AIP1）。有研究发现，大部分肿瘤组织中，表观遗传学调控抑制了DAB2IP的表达，膀胱癌中启动子甲基化和组蛋白修饰会抑制DAB2IP的表达，表明

DAB2IP

可能作为抑癌基因，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移过程。本研究探讨DAB2IP、caspase 8在BCC中的表达情况及作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月至2019年7月新乡医学院第三附属医院收治的BCC患者。纳入标准：①均经病理学检查确诊为BCC；②无其他任何皮肤疾病；③无其他系统性疾病或恶性肿瘤；④病历资料完整。排除标准：①术前未接受系统治疗；②皮肤科和病理科医师在复核诊断过程中未达成一致意见的患者。依据纳入和排除标准，本研究共纳入80例BCC患者，其中男36例，女44例；年龄26～79岁，平均（59.3±11.5）岁。同期选取30例接受整形外科手术的健康者，其中男13例，女17例；年龄31～69岁，平均（55.2±12.1）岁。取80例BCC患者手术切除的BCC组织，取30例健康者的正常皮肤组织，皮肤组织均取自头面部。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞、主要试剂和仪器 人BCC细胞系TE-354.T购自北京中源合聚生物科技有限公司。

DAB2IP

抑制物（si-DAB2IP）、阴性对照（si-NC）均购自上海吉玛生物有限公司，细胞转染试剂Lipofectamine 2000购自购自美国Thermo Fisher Scientific公司，组织RNA提取Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）荧光定量试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物科技有限公司，兔抗人DAB2IP、caspase 8抗体均购自美国Abcam公司。所有目的基因引物均由广州锐博生物科技有限公司合成。1.2.2 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）检 测

DAB 2IP

mRNA的相对表达量 取BCC组织和正常皮肤组织充分研磨后，按照Trizol试剂盒说明书提取组织中的总RNA，转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA）。按照RT-PCR试剂盒说明书将所需试剂依次加入实时荧光定量PCR中进行扩增。

DAB2IP

mRNA的相对表达量采用2法计算。

DAB2IP

上游引物：5'-CTGAGCGGGATAAGTGGATGG-3'，下游引物：5'-AAACATTGTCCGTCTTGAGCTT-3'；

GAPDH

上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物 ：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

1.2.3 细胞转染和分组 按照细胞转染试剂盒Lipofectamine 2000操作说明，分别将si-DAB2IP、si-NC通过脂质体转染至BCC细胞系TE-354.T，分别作为si-DAB2IP组和si-NC组，置于37℃条件下培养48 h，用于后续实验。

1.2.4 蛋白质印迹（Westernblot）法检测DAB 2IP、caspase8蛋白的相对表达量 取适量BCC组织、正常皮肤组织、si-DAB2IP组细胞、si-NC组细胞，加入放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）组织裂解液，充分研磨后，离心提取上清液中的蛋白。取适量提取的蛋白用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDSPAGE）进行分离，用聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜进行湿法转膜，加入 DAB2IP、caspase 8一抗（稀释浓度为1∶1000）孵育2 h，5%的牛奶固定，4℃环境下孵育过夜，次日37℃摇床复温1 h，加入二抗继续孵育1 h。洗膜后电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）法显影，以β-actin为内参，Image J软件分析条带灰度值，计算DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 BCC组织和正常皮肤组织中DAB 2IP mRNA相对表达量的比较

BCC组织中

DAB2IP

mRNA的相对表达量为（0.56±0.24），明显低于正常皮肤组织中的（2.31±1.12），差异有统计学意义（

t

=13.278，

P

＜0.01）。

2.2 BCC组织和正常皮肤组织中DAB 2IP、caspase8蛋白相对表达量的比较

BCC组织中DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量均明显低于正常皮肤组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表1）

表1 BCC组织和正常皮肤组织中DAB 2IP、caspase 8蛋白相对表达量的比较（x-± s）

2.3 抑制DAB 2IP基因的表达对BCC细胞DAB 2IP、caspase8蛋白表达的影响

抑制

DAB2IP

基因的表达后，si-DAB2IP组细胞中DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量均明显低于si-NC组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表2）

表2 si-DAB 2IP组和si-NC组BCC细胞DAB 2IP、caspase 8蛋白相对表达量的比较（±s）

2.4 不同临床特征BCC患者BCC组织中caspase8、DAB 2IP蛋白相对表达量的比较

不同性别、年龄BCC患者BCC组织中caspase 8、DAB2IP蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）；肿瘤直径≥1 cm、病理类型为浅表型BCC患者BCC组织中DAB2IP蛋白相对表达量均高于肿瘤直径＜1 cm、病理类型为浸润型患者，差异均有统计学意义（

t

=5.856、2.150，

P

＜0.05）；肿瘤直径≥1 cm、病理类型为浅表型BCC患者BCC组织中caspase 8蛋白相对表达量均高于肿瘤直径＜1 cm、病理类型为浸润型患者，差异均有统计学意义（

t

=3.121、2.250，

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同临床特征BCC患者BCC组织中DAB 2IP、caspase 8蛋白的相对表达量（ n=80）

2.5 相关性分析

Pearson相关分析结果表明，BCC组织中caspase 8的表达与DAB2IP的表达呈正相关（

r

=0.72，

P

＜0.05）。

3 讨论

基底细胞癌对人体头面部组织破坏性较强，过度的日光照射是BCC发生的最主要原因。欧美白色人种是BCC的高风险人群，有研究表明，欧美白色人种患BCC的风险超过30%。目前，BCC的治疗方案仍以手术和放疗为主，尚无特异性的治疗方案。

DAB2IP

位于人类染色体9q33.1～q33.3，包含15个外显子和14个内含子，编码967个氨基酸，长度96 kb左右，分子量110 kD。2002年，DAB2IP首次在膀胱癌细胞中被确定为一种DOC-2/DAB2结合蛋白，具有调节细胞存活、增殖、凋亡、上皮-间充质转化、肿瘤干细胞形态、放化疗耐受性的作用，还能抑制膀胱癌细胞的生长。随后，DAB2IP在肿瘤中的功能被广泛研究。Calvisi等的研究发现，抑制肝癌细胞中DAB2IP的表达可以明显促进肝癌细胞的增殖。Yang等的研究发现，

DAB2IP

基因突变会显著增加肺癌的发病风险。2017年，Sears和Gray的研究发现，抑制DAB2IP的活性会明显增强乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。Sun等的研究表明，DAB2IP可以通过激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/ERK2信号通路抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力。但目前很少有学者探讨DAB2IP在BCC中的作用，袁绍萍等在研究BCC组织时发现，DAB2IP在BCC患者BCC组织中表达下调，提示

DAB2IP

可能在BCC中发挥抑癌基因的作用。但目前关于DAB2IP抑制BCC进展的具体机制尚不明确。本研究采用RT-PCR法检测BCC组织和正常组织中

DAB2IP

mRNA的相对表达量，Western blot法检测DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量，结果发现，BCC组织中

DAB2IP

mRNA的相对表达量明显低于正常皮肤组织，DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量均明显低于正常皮肤组织，提示DAB2IP、caspase 8可能具有抑制BCC的作用。caspase 8是一种经典的细胞凋亡调节因子，在细胞凋亡信号转导中发挥重要作用。caspase 8作为细胞内特殊的环境感受器，在多种肿瘤组织中表达下调，可通过激活细胞内一系列的信号通路，调控细胞凋亡。Yan等的研究发现，促进caspase 8蛋白在胃癌细胞中的表达可以显著抑制胃癌细胞的生长。Yang等的研究证实，miRNA-376a可以通过靶向caspase 8促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭。由此可见，caspase 8可能具有广泛的抗肿瘤作用。Kong等的研究发现，DAB2IP可以通过促进caspase 8的表达来抑制膀胱癌细胞的增殖，并增强膀胱癌细胞对放疗的敏感性。本研究通过小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制BCC细胞中

DAB2IP

基因的表达，通过Western blot法检测细胞中caspase 8的相对表达量，结果发现，caspase 8的表达同样被抑制，表明DAB2IP可能通过调控caspase 8的表达抑制BCC细胞的生长。

此外，本研究还分析了DAB2IP、caspase 8表达与BCC患者临床特征间的关系，结果发现，肿瘤直径≥1 cm、病理类型为浅表型BCC患者BCC组织中DAB2IP、caspase 8蛋白相对表达量均高于肿瘤直径＜1 cm、病理类型为浸润型患者，提示DAB2IP、caspase 8可能参与调控了BCC细胞的生长和侵袭过程。

综上所述，DAB2IP、caspase 8在BCC组织中低表达，DAB2IP可能通过促进caspase 8的表达发挥抗肿瘤作用，靶向DAB2IP有望成为BCC新的治疗方案。