血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子在宫颈癌中的表达及其与微血管密度的关系

刘松格，谷见法，潘琼，易善永

郑州大学附属郑州中心医院肿瘤内科，郑州 467000

宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性恶性肿 瘤，流行病学报道近年来宫颈癌逐渐呈现年轻化趋势，严重威胁女性的生命健康。随着分子生物学的发展，分子生物学指标在恶性肿瘤发生、发展过程中的作用得到逐步重视。血管生成被认为是肿瘤发展的重要病理改变，这一过程是在多种细胞因子调控下完成，目前研究已鉴定了多种与血管生成相关的因子。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种具有高度特异性及选择性的有丝分裂原，研究表明该生长因子在体外可诱导内皮细胞的增殖、迁移及凋亡，而在体内其可刺激血管内皮细胞的增殖从而促进血管的形成。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是调节神经及血管形成的多肽生长因子，广泛分布于机体多种组织，对多种类型细胞的生长、分化及功能调节均有影响。本研究旨在探讨宫颈癌患者VEGF、bFGF的表达水平与微血管密度（microvessel density，MVD）的关系，以期明确宫颈癌的发生发展过程中组织病理变化及相关因子表达的改变，为宫颈癌诊断及病情评估提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年6月至2018年9月于郑州大学附属郑州中心医院行外科手术的宫颈癌患者。纳入标准：初诊患者；经病理组织学检查确诊为宫颈鳞状细胞癌；临床资料完整。排除标准：术前行其他抗肿瘤治疗；合并其他全身性疾病；合并心脑血管疾病；合并精神性疾病。根据纳入与排除标准，共选取118例宫颈癌患者作为宫颈癌组，年龄33～68岁，平均（51.48±10.27）岁。另选取同期郑州大学附属郑州中心医院收治的宫颈上皮内瘤变、宫颈炎患者，纳入标准：液基薄层细胞检测及临床检查提示为宫颈上皮内瘤变、宫颈炎；临床资料完整。排除标准：合并全身性疾病、心脑血管疾病、精神性疾病。根据纳入与排除标准，共选取71例宫颈上皮内瘤变患者作为瘤变组，年龄29～77岁，平均（50.96±8.88）岁；共选取50例宫颈炎患者作为对照组，年龄22～70岁，平均（51.26±9.02）岁。收集宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变组织、宫颈炎组织进行研究。

1.2 方法

使用免疫组织化学染色法检测VEGF、bFGF的表达情况，试剂均由Santa Cruz公司提供，其中VEGF抗体稀释浓度为1∶200，bFGF稀释浓度为1∶500。所有组织标本均采用多聚甲醛固定，石蜡包埋，并采用切片机切取4 μm切片，切片脱蜡后采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗，以3%过氧化氢室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗后加入5%牛血清孵育10 min；滴加一抗置于4℃环境下孵育过夜，冲洗后二抗室温孵育20 min，冲洗后加入链亲和素-过氧化物酶孵育20 min，冲洗后采用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，经脱水、透明、封片等操作完成制片。在光学显微镜（日本奥林巴斯公司）下观察切片，阳性细胞为细胞质呈弥散的棕黄色，对显微镜下视野内的阳性细胞进行计数，以阳性细胞百分率≥10%为阳性，阳性细胞百分率＜10%为阴性。结果判定由2名高年资病理学医师独立进行观察，意见不一致的病例经探讨后给出最终结论。

采用免疫组织化学染色法以CD34单克隆抗体标记测定MVD，染色方法同上，以与邻近细胞、结缔组织界限清晰且呈棕色染色的内皮细胞或细胞群作为一个血管，先在低倍镜下寻找血管密度较高的5个区域，然后在高倍镜下进行MVD计数，以5个区域的均值作为该样本的MVD值。细胞计数由两名高年资病理医师在双盲情况下进行，以两位医师计算的平均值作为最终结果。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 VEGF、bFGF表达情况的比较

宫颈癌组、瘤变组及对照组患者VEGF、bFGF阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）；宫颈癌组、瘤变组患者VEGF、bFGF阳性表达率均明显高于对照组（

P

＜0.01），且宫颈癌组患者VEGF、bFGF阳性表达率均明显高于瘤变组（

P

＜0.01）。（表1、图1）

表1 各组患者中VEGF、bFGF阳性表达情况的比较[ n（%）]

图1 宫颈癌组织中VEGF、bFGF的阳性表达情况（免疫组织化学染色法）

2.2 MVD的比较

宫颈癌组、瘤变组及对照组患者中MVD计数依次为（37.41±5.27）、（27.84±4.59）、（15.42±4.25），三组比较差异有统计学意义（

F

=366.857，

P

＜0.01），宫颈癌组、瘤变组患者中MVD均明显高于对照组（

P

＜0.01），且宫颈癌组MVD明显高于瘤变组（

P

＜0.01）。

2.3 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中VEGF、bFGF阳性表达率及MVD的比较

不同国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、淋巴结转移情况宫颈癌患者宫颈癌组织中VEGF、bFGF阳性表达率的比较，差异均有统计学意义（

χ

=4.395、6.676，

P

=0.036、0.009）。不同分化程度、FIGO分期、淋巴结转移情况、肿瘤浸润深度宫颈癌患者宫颈癌组织中MVD的比较，差异均有统计学意义（

t

=4.685、6.195、8.013、5.237，

P

＜0.01）。（表2）

表2 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中VEGF、bFGF阳性表达率及MVD的比较（ n=118）

2.4 宫颈癌组织中VEGF、bFGF阳性表达与MVD计数的相关性分析

Spearman相关性分析示，宫颈癌组织中VEGF、bFGF阳性表达与MVD呈正相关（

r

=0.529、0.601，

P

＜0.05）。

3 讨论

研究认为，实体瘤的发生及转移均与血管的生成相关，血管生成是肿瘤生长及浸润的形态学基础，也是其生物学行为中的重要部分，因此对血管生成的研究可明确良性疾病的恶变趋势，也可反映恶性病灶的生物学行为。

本研究结果显示，宫颈癌组及瘤变组患者VEGF、bFGF阳性表达率均明显高于对照组，且宫颈癌组阳性表达率最高，提示VEGF、bFGF的高表达可能与宫颈癌的发生相关。采用CD34免疫组织化学染色方法测定各组织中的MVD，结果显示，宫颈癌组织MVD明显高于瘤变组及对照组，提示宫颈癌患者也可伴有MVD的增加。周庆红等研究比较了宫颈癌组、宫颈瘤变组及宫颈炎组患者VEGF、bFGF表达水平，结果也证实宫颈癌组及宫颈瘤变组患者可伴有VEGF、bFGF阳性表达率升高，且宫颈癌组患者阳性表达率均高于宫颈瘤变组。梁志洪等对宫颈癌及宫颈息肉组织中

bFGF

mRNA表达情况分析证实，宫颈癌表达量明显高于宫颈息肉组。Sidorkiewicz等研究证实，宫颈鳞状细胞癌及腺癌中VEGF表达均明显升高，与本研究结果相似。

本研究对不同临床特征的宫颈癌患者进行研究，结果显示，VEGF、bFGF阳性表达率可能与宫颈癌FIGO分期及淋巴结转移有关，具体表现为宫颈癌FIGO分期越高其阳性表达率越高，伴有淋巴结转移的患者阳性表达率越高，这一结果提示VEGF、bFGF的表达可能在宫颈癌进展、侵袭及转移过程中具有重要作用。另外，在宫颈癌患者宫颈癌组织中，MVD与患者分化程度、FIGO分期及淋巴结转移相关，提示MVD与肿瘤的发生及发展也存在密切关系。VEGF一方面可诱导新生毛细血管的生成为肿瘤生长提供营养及代谢，另一方面VEGF也可直接促进肿瘤细胞的生长；另外，新生血管内皮常有裂隙，VEGF可促进内皮细胞释放胶原酶使肿瘤细胞及肿瘤组织分离、脱落，为肿瘤的转移提供条件。目前关于VEGF及bFGF表达量与宫颈癌临床特征的关系研究较多，但报道的相关性不尽相同。杜俊俊等的研究证实，宫颈癌患者VEGF表达与病理学分级及淋巴结转移相关，而与病理组织学类型、FIGO分期无明显相关。陈舒等证实不同FIGO分期与淋巴结转移患者的VEGF阳性表达率差异显著。国外一项研究证实，VEGF与宫颈癌组织病理学分级无明显相关性，各研究存在一定差异的原因可能与研究对象、指标的阳性判断标准差异相关。

如上文所述，宫颈癌患者宫颈癌组织中均可伴有VEGF、bFGF阳性表达率升高及MVD升高，对两者关系进行研究可能可对MVD的形成机制有一定参考。本研究结果显示，VEGF及bFGF阳性表达率与宫颈癌患者宫颈癌组织中MVD呈正相关，进一步证实VEGF、bFGF表达上调可能与MVD的升高存在密切关系，提示VEGF及bFGF阳性表达率的升高可能促进宫颈癌微血管新生能力，从而提高宫颈癌侵袭转移能力的重要因素。目前已有靶向调控VEGF、bFGF从而实现抗肿瘤效应的报道。本研究证实了VEGF、bFGF与血管新生存在一定关系，或可为靶向治疗提供一定参考。

综上所述，宫颈癌组织中可伴有VEGF、bFGF阳性表达率的升高及MVD的升高，其升高与宫颈癌肿瘤侵袭性及病灶转移相关，这些指标可作为宫颈癌诊断、病情评估的参考指标。VEGF、bFGF的表达与宫颈癌组织MVD密切相关，VEGF、bFGF表达水平的增加可能为宫颈癌组织微血管生成的重要机制之一，基于此，VEGF、bFGF可作为抗肿瘤血管生成、延缓病情进展的重要靶点，考虑到肿瘤血管生长因子的异质性，通过检测个体生长因子的表达可为干预方案的制订提供参考。