黄芪保心汤对慢性心力衰竭模型大鼠心室重构及内质网应激凋亡的抑制作用

丁宇　赵殿臣　赏楠

摘要 目的：研究黃芪保心汤对慢性心力衰竭模型大鼠心室重构及内质网应激凋亡的抑制作用。方法：选取健康雄性SD级大鼠60只进行研究，将其按照随机抽签法等分成干预组、对照组以及模型组，每组20只。干预组与模型组大鼠建立慢性心力衰竭模型，对照组大鼠予以假手术处理。造模成功后，干预组予以黄芪保心汤干预，模型组、对照组大鼠予以等量生理盐水注射干预。比较3组大鼠干预4周后的心功能，血清NT-proBNP、ST2水平，心肌细胞凋亡率以及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。结果：模型组大鼠左室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（FS）、每搏输出量（SV）水平显著低于对照组，而左室收缩末期直径（LVESD）、左室舒张末内径（LVEDD）水平显著高于对照组;干预组大鼠LVEF、FS、SV水平显著高于模型组，且LVESD、LVEDD水平显著低于模型组（均P<0.05）。模型组大鼠NT-proBNP、ST2水平均显著高于对照组，而干预组大鼠N端脑钠肽前体（NT-proBNP）、基质裂解素2（ST2）水平均显著低于模型组（均P<0.05）。模型组大鼠的心肌细胞凋亡率显著高于对照组，而干预组大鼠的心肌细胞凋亡率显著低于模型组（均P<0.05）。模型组大鼠心肌Bcl-2蛋白表达水平显著低于对照组，而Bax以及Caspase-3蛋白表达水平显著高于对照组;干预组大鼠心肌Bcl-2蛋白表达水平显著高于模型组，且Bax以及Caspase-3蛋白表达水平显著低于模型组（均P<0.05）。结论：黄芪保心汤可有效抑制慢性心力衰竭模型大鼠心室重构及内质网应激凋亡，其主要作用机制可能和影响心肌Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表达有关。

关键词 慢性心力衰竭;动物实验;黄芪保心汤;心室重构;内质网应激凋亡;心功能;N端脑钠肽前体;基质裂解素2

Abstract Objective：To investigate the inhibitory effect of Huangqi Baoxin decoction on ventricular remodeling and endoplasmic reticulum stress apoptosis in rats with chronic heart failure.Methods：Sixty healthy male SD rats were selected for the study，and then randomly divided into a intervention group，a control group and a model group，with 20 rats in each.The rats in the intervention group and the model group were treated with sham surgery.After successful modeling，Huangqi Baoxin Decoction was given to the intervention group，and rats in the model group and control group were injected with equal amount of saline.Cardiac function，levels of serum NT-proBNP and ST2，apoptosis rate of cardiomyocytes，expression levels of bcl-2，Bax and caspase-3 were compared after 4 weeks of intervention among the three groups.Results：The levels of LVEF，FS and SV in the model group were significantly lower than those in the control group，while the levels of LVESD and LVEDD were significantly higher than those in the control group; The levels of LVEF，FS and SV in the intervention group were significantly higher than those in the model group，and the levels of LVESD and LVEDD were significantly lower than those in the model group（P<0.05）.The levels of NT-proBNP and ST2 in the model group were significantly higher than those in the control group，while the levels of NT-proBNP and ST2 in the intervention group were significantly lower than those in the model group（P<0.05）.The apoptosis rate of cardiomyocytes in the model group was significantly higher than that in the control group，while that in the intervention group was significantly lower than that in the model group（P<0.05）.The expression level of bcl-2 protein in the model group was significantly lower than that in the control group，while the expression level of Bax and caspase-3 protein was significantly higher than that in the control group.The expression level of bcl-2 protein in rats in the intervention group was significantly higher than that in the model group，and the expression level of Bax and caspase-3 protein was significantly lower than that in the model group（P<0.05）.Conclusion：Huangqi Baoxin decoction can inhibit ventricular remodeling and endoplasmic reticulum stress apoptosis in rats with chronic heart failure，and its main mechanism may be associated with the expression of bcl-2，Bax and caspase-3 in myocardium.

Keywords Chronic heart failure; Animal experiments; Huangqi Baoxin decoction; Ventricular remodeling; Endoplasmic reticulum stress apoptosis; Cardiac function; N-terminal forebrain natriuretic hormone; Matrix lysin 2

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.010

随着近年来人们生活水平的不断提高以及人口老龄化问题的日益凸显，慢性心力衰竭的发病率正呈逐年升高趋势，该病患者预后普遍较差，5年生存率不足50%[1-2]。心室重构乃是慢性心力衰竭的发病基础，其主要表现包括心肌纤维化，其和心肌梗死、瓣膜病以及心肌疾病等密切相关，往往是由过度的心室负荷和（或）心肌成活细胞大量减少导致[3-4]。心室重构的分子机制相对复杂，细胞凋亡、胚胎基因以及蛋白的再编码等因素均可能增加心室重构的发生。此外，内质网属于细胞内最大细胞器，亦是蛋白质修饰、折叠以及钙储存的重要场所之一[5-6]。一系列病理因素均可能引起内质网内未折叠或错折叠蛋白的过度积聚以及钙稳态失衡，进一步引发内质网应激反应的发生，其中持续过度的内质网应激反应会对细胞造成显著的损害，促使内环境紊乱难以快速恢复，从而引起信号从促生存向促凋亡機制转变，最终诱发细胞凋亡[7-8]。鉴于此，本研究通过探讨黄芪保心汤对慢性心力衰竭模型大鼠心室重构及内质网应激凋亡的抑制作用，旨在明确黄芪保心汤治疗慢性心力衰竭的重要机制，继而为其应用于临床治疗中提供理论依据，现作以下报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取健康雄性SD级大鼠60只进行研究，体质量200～220 g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号：粤监证字2012c066。所有大鼠均常规喂养于室温20～24 ℃，湿度40%的条件下，只有进食以及饮水。

1.1.2 药物 黄芪保心汤（江苏颐海药业有限责任公司，生产批号：160601）;水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，生产批号：20130426）;肝素钠注射液骨质（江苏万邦生化医药股份有限公司，生产批号：51605116）。

1.1.3 试剂与仪器 甲醛（南京化学试剂有限公司，批号：14021810257）;HE染色剂（湖北百奥斯生物科技有限公司，批号：BP0210）;中性树脂（国药集团，批号：10004160）;大鼠N端脑钠肽前体（NT-proBNP）和基质裂解素2（ST2）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：19021250257）;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司，货号：C0003）;小鼠超敏二步法检测试剂盒（货号：D1103）、DAB显色试剂盒（货号：S-1503）、柠檬酸盐缓冲液（货号：QN0125）购于北京中杉金桥生物技术有限公司;兔抗Bcl-2（货号：P4768）、Bax（货号：N3168）、Caspase-3多克隆抗体（货号：ABP0114）购自英国Abcam公司;RIPA裂解液（货号：P0013D）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：AR0146）购自碧云天生物技术有限公司。VM7型便携式彩色多普勒超声诊断仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：Vivid i）;电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司，型号：BSA423S）;离心机（Eppendorf公司，德国，型号：iCEN-24R）;超低温冰箱（Thermo Scientific公司，美国，型号：Lexicon Ⅱ）;CX31显微镜（Olympus，日本，型号：CX31）;超净工作台（苏净集团安泰公司，型号：KLCZ系列）;电泳仪（BIO-RAD公司，美国，型号：Bio-Rad iQ5）;脱色摇床（海门市麒麟医用仪器厂，型号：TS-3）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1）大鼠分组：将所有大鼠按照随机抽签法等分成干预组、对照组以及模型组，每组20只。2）大鼠处理：干预组与模型组大鼠均进行慢性心力衰竭造模：采用3%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉处理，使用剂量为1.5 mL/kg，取腹部正中剑突下作一2 cm的切口，依次切开皮肤、打开腹腔，于左肾动脉上方分离腹主动脉。随后取0号丝线穿过，取7号手术针（已区尖磨钝）放置在丝线部位，结扎丝线，抽取手术针，明确腹主动脉通畅后关腹。对照组大鼠仅分离腹主动脉，但不结扎处理。

1.2.2 干预方式 干预组大鼠予以黄芪保心汤干预，及予以黄芪保心汤22.68 g生药/（kg·d），连续干预4周。模型组大鼠和对照组大鼠予以等量生理盐水注射干预，使用剂量为12 mL/kg，1次/周，连续干预4周。

1.2.3 心脏超声检测 3组大鼠干预4周后均取仰卧位，以VM7型便携式彩色多普勒超声诊断仪进行扫描，取胸骨旁左室长轴切面，获取左心室标准区图像，分别完成左室射血分数（LVEF）、左室收缩末期直径（LVESD）、左室舒张末内径（LVEDD）、左心室短轴缩短率（FS）、每搏输出量（SV）的测量，结果均取3个心动周期的平均值。

1.2.4 NT-proBNP、ST2水平检测 对大鼠实施开腹、分离腹主静脉处理，取静脉血5 mL，以3 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，取血清以ELISA进行检测，具体操作务必以试剂盒说明书为主。

1.2.5 心肌细胞凋亡检测 采用TUNEL染色心肌组织，于光学显微镜下计数并拍照，遵循一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒说明书完成心肌细胞凋亡情况的检测。

1.2.6 心肌Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表达检测 以Western Blotting法完成，具体操作务必按照试剂盒说明书进行，采用Image J软件实施灰度分析，检测蛋白和内参β-actin的灰度比值校正误差，以相对灰度值表示蛋白相对表达水平。

1.2.7 评价标准 慢性心力衰竭大鼠造模成功标准如下[9-10]：造模后大鼠常规喂养逐渐出现呼吸加快、心跳加快以及食欲减退等表现，且LVEF<60%，左心室舒张末压（LVEDP）≥15 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。

1.3 統计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，予以t检验。多组间对比采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠心脏彩超指标比较 模型组大鼠LVEF、FS、SV水平显著低于对照组，而LVESD、LVEDD水平显著高于对照组;干预组大鼠LVEF、FS、SV水平显著高于模型组，且LVESD、LVEDD水平显著低于模型组（均P<0.05）。见表1。

2.2 3组大鼠NT-proBNP、ST2水平比较 模型组大鼠NT-proBNP、ST2水平均显著高于对照组，而干预组大鼠NT-proBNP、ST2水平均显著低于模型组（均P<0.05）。见表2。

2.3 3组大鼠心肌细胞凋亡率比较 模型组大鼠的心肌细胞凋亡率显著高于对照组，而干预组大鼠的心肌细胞凋亡率显著低于模型组（均P<0.05）。见表3。

2.4 3组大鼠心肌Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表达水平比较 模型组大鼠心肌Bcl-2蛋白表达水平显著低于对照组，而Bax以及Caspase-3蛋白表达水平显著高于对照组;干预组大鼠心肌Bcl-2蛋白表达水平显著高于模型组，且Bax以及Caspase-3蛋白表达水平显著低于模型组（均P<0.05）。见表4，图1。

3 讨论

随着近年来中医药在临床慢性心力衰竭中的应用日益广泛，因其具有多途径、多靶点、多环节以及安全性较高等特点，从而受到国内外的重点关注[11-12]。黄芪保心汤是我国张培影教授通过多年的临床经验总结，综合中医经典理论以及现代药理学研究，精心化裁组方而来，且应用于临床疾病的治疗中时间较长，疗效明显[13-15]。迄今为止，临床上尚未见到黄芪保心汤治疗慢性心力衰竭大鼠模型的相关研究。鉴于前期临床以及基础工作，设想黄芪保心汤可能抑制抑制神经内分泌系统激活，继而逆转慢性心力衰竭心室重构的发生，其分支作用机制可能和抑制内质网应激参与的心肌细胞凋亡密切相关。故此，本研究通过建立慢性心力衰竭大鼠模型，探讨黄芪保心汤改善大鼠心室重构的作用，并分析其对内质网应激凋亡的抑制作用，旨在明确黄芪保心汤抑制慢性心力衰竭大鼠心室重构的分子机制。

本研究结果发现，模型组大鼠的心功能相较于对照组明显更差，而干预组大鼠心功能明显优于对照组。这表明了黄芪保心汤应用于慢性心力衰竭模型大鼠中的效果显著，可促进大鼠心功能的恢复。分析原因，可认为黄芪保心汤以黄芪、党参为君药，具有健脾益气以及滋养五脏的功效;以鳖甲、当归、丹参以及连翘作为臣药，具有养阴助黄芪、党参两君药扶正，亦可发挥解毒化瘀的功效;麦冬、五味子乃是佐药，可辅助君臣发挥益气生津以及养心安神的功效;桂枝以及茯苓属使药，主要是发挥中阳得运、水湿得利的功效[16]。诸药共用，可达益气养阴、祛邪扶正、解毒化瘀的功效，使固五脏之本，贯通心脉、血运不息，邪去乃心安[17-19]。此外，黄芪保心汤干预可显著降低慢性心力衰竭模型大鼠NT-proBNP、ST2水平。这表明了黄芪保心汤可有效抑制慢性心力衰竭模型大鼠心室重构。究其原因，可认为NT-proBNP是自体心室细胞所分泌而来的一种激素，其浓度的高低可反映心力衰竭程度以及评估预后，乃是公认的心力衰竭评价指标[20-22]。ST2主要是心肌遭受机械刺激后，在相应的应变力状态下自发产生的蛋白之一，其可通过成纤维细胞以正常细胞进行表达，可作为心肌肥厚以及心肌纤维化的指标，且不会受到肾功能、年龄、体质量等因素的影响[23-24]。另外，黄芪保心汤干预可有效抑制慢性心力衰竭大鼠的心肌细胞凋亡。其中主要原因可能在于：黄芪保心汤有效改善慢性心力衰竭大鼠心脏扩大、纤维化以及心功能异常，通过调节氧化因子、抑制RAAS神经内分泌因子激活，继而发挥抑制心室重构的作用。另外，黄芪保心汤干预可明显上调慢性心力衰竭模型大鼠的心肌Bcl-2蛋白表达，同时下调Bax以及Caspase-3蛋白表达。其中Bcl-2是最早被证实和凋亡密切相关的基因之一，其具有差异性Bcl-2同源结构域，且对多种因素导致的细胞凋亡均具有显著的抑制作用，其可作为凋亡各种信号途径存在共有通路以及节点，对细胞凋亡具有调控作用[25-26]。Bax基因则和Bcl-2存在相反的作用，其转录的Bax蛋白和Bcl-2蛋白存在同源性，上述2种蛋白和结合形成异二聚体，从而对Bcl-2的抗凋亡作用产生抑制[27-28]。由此可见，Bax蛋白的高表达可促进细胞凋亡的发生，而Bcl-2的高表达可抑制细胞的凋亡，二者表达水平的平衡是细胞凋亡程度调控的重要机制，共同决定着细胞的命运。而Caspase-3参与了心肌凋亡的死亡受体途径以及线粒体途径，其不但可接收上游传导的凋亡信号，而且可作为最终凋亡效应因子，从而执行细胞凋亡，是凋亡过程中最为重要的一种蛋白酶，其在心肌组织中的表达水平可在一定程度上反映心肌细胞凋亡程度[29-30]。这充分说明了黄芪保心汤有效抑制慢性心力衰竭大鼠的内质网应激凋亡，其主要作用机制可能和影响心肌Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表达有关。然而，本研究尚且存在一定的局限性，如实验未开展多个干预时间点的比较研究，且未对内质网应激介导的凋亡通路进行全面研究等。这为我们今后的研究提供了新的方向和思路。

综上所述，黄芪保心汤可通过抑制慢性心力衰竭模型大鼠心室重构及内质网应激凋亡，继而促进心功能的恢复。

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（2020-01-07收稿 责任编辑：王明）