硝苯地平对大鼠牙龈退缩的治疗研究

姜春慧，陈永吉，李孝迪，纪 悦，胡佳敏，杨如会

（丽水学院医学院，浙江丽水 323000）

牙龈退缩，指牙龈缘向釉牙骨质界的根方退缩导致的牙根暴露，多为牙周炎的伴发病变，其主要病理改变为牙龈组织中胶原纤维的减少、胶原排列稀疏、黏附性降低等，严重的牙龈退缩可伴发牙槽骨的吸收[1]。牙龈退缩是导致食物嵌塞、牙齿松动和脱落等口腔疾病的重要原因[2]。牙龈退缩目前尚缺乏特效治疗方法，寻找有效的治疗牙龈退缩的防治药物对改善口腔卫生具有重要意义。

硝苯地平（Nifedipine,Nif）是预防和治疗冠心病、心绞痛的常用药物，药物性牙龈增生是硝苯地平特有的不良反应之一[3]。目前认为Nif能够诱导牙龈角质细胞生长因子及其受体诱导胶原合成，促进牙龈组织Wnt1和β-catenin的基因和蛋白表达[4]；并通过干扰细胞内钙离子流动降低整合素α2β1结合力，从而降低整合素介导的成纤维细胞的吞噬胶原的功能[5]。Nif通过上述作用增加牙龈胶原的产生并减少胶原的降解。上述研究表明，Nif对牙龈组织的作用，提示Nif可能具有增加退缩牙龈细胞修复增殖能力及改善牙龈退缩的作用。本研究拟通过动物模型试验验证该假说，为开发防治牙龈萎缩的药物做研究基础，并对牙龈退缩的机制做探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

Nif平标准品（中检所，批号：100338）；脂多糖（LPS,Sigma，L2630）；成年SD大鼠40只，体重220±20g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005；病理HE染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，D006-1-1）；Masson染色试剂盒（Solarbio，G1345）；TGF-β1一抗（abcam，ab190503）、Keratin 5（Krt5）一抗（abcam，ab64081）；离心柱形RNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程公司，GK3016）；RT SuperMix逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物公司，货号R222-01）；定量PCR试剂盒（南京诺唯赞生物公司，Q411-02）；Micro-CT（Genoray，Papaya 3D Plus）；游标卡尺（晶思达，JSD-KC）；定量PCR仪（BIO-RAD，CFX Connect Real-Time System）；显微镜（OLYMPUS，BX43）。

1.2 Nif水凝胶的制备

分别把Nif标准品（中检所，批号：100338）100 mg和50 mg分别溶于50 mL2%羧甲基纤维素钠溶液中，磁转子搅拌2 h，分别制备成1 mg/mL和2 mg/mL浓度的Nif水凝胶，4℃冷藏储备。

1.3 动物分组

针对牙龈退缩的主要原因，设计大鼠牙龈退缩模型。按体重随机分为4组，分别为空白对照组（Control）、模型组（Model）、模型+Nif高剂量（2 mg/mL）组、模型+Nif低剂量组（1 mg/mL）。每组8～10只，屏障动物实验室喂养，温度22℃～26℃，相对湿度60%～80%，常规标准大鼠颗粒饲料喂养。

1.4 牙龈退缩模型复制方法

参考相关文献[6-7]，采用改良手术方法复制大鼠牙龈退缩模型：SD大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠6 mL/kg麻醉。大鼠被固定于手术板上，使其面部朝上，固定四肢，大鼠开口器分开上下颌，暴露上颌磨牙区，碘伏对上颌磨牙及近中黏膜区进行表面消毒，沿着大鼠上颌第一磨牙近中端部位用刀片割开3 mm左右，暴露上颌近中牙龈，并剥离牙龈组织，手持牙科低速手机，以400～500 r/min的转速用慢速球钻在上颌第一磨牙近中端的牙龈下组织制备骨缺损（4 mm×2 mm×2 mm）。伤口用医用缝合线小心缝合，缝合后进行表面消毒。实验完毕后，将大鼠放置于实验室的鼠笼中，定期观察大鼠，正常饮食。大鼠牙龈伤口可在术后数天内痊愈，同时每天用棉签在患处涂1 mg/mL的LPS溶液1次，手术完成15 d后观察大鼠牙龈退缩改变，明确牙龈退缩模型成功。

1.5 药物干预方法

经病理验证模型成功后，按组别设计分别进行药物干预：大鼠头部固定后，用开口器固定口腔，用修剪的儿童牙刷把凝胶反复涂抹患处，持续1 min，每日早晚2次，持续18 d，对照组和模型组用凝胶辅料进行干预。

1.6 牙龈退缩测量

每3 d用游标卡尺测量1次牙龈退缩变化，并观察牙龈黏膜损伤后愈合情况。

1.7 Micro-CT扫描组织

18 d末，将大鼠麻醉后，用Micro-CT进行口腔牙龈扫描，扫描精度15μm，扫描结束后对大鼠牙龈组织进行测量分析。

1.8 病理HE染色和Masson染色

大鼠麻醉处死后，取部分大鼠牙龈组织浸入10%EDTA溶液中脱钙，每3 d更换1次溶液，3周后梯度酒精脱水、石蜡包埋切片，4μm切片，按试剂盒说明书进行HE和Masson染色，观察牙龈组织、黏膜、牙槽骨等病理改变。

1.9 牙龈组织TGF-β1、Krt5免疫组化染色

采用过氧化物酶标记的免疫组化法分别行TGF-β1、Krt5染色。免疫组化评分：染色结果采用半定量分析方法，以染色强度结合阳性细胞数百分比进行评分。染色强度以多数细胞呈现的染色强度并减去背景着色计分：无明显着色为0分，轻微为1分，中度为2分，重度为3分。阳性细胞百分比：0%～5%评为0分，6%～25%评1分，26%～50%评2分，51%～75%评3分，＞75%均评为4分。最终评分为阳性细胞百分比得分与染色强度得分的和：0分为阴性，3分为弱阳性，4～5分为中度阳性，6～7分为强阳性[8]。

1.10 Real-Time PCR检测TGF-β1、Krt5基因表达

取部分牙龈组织，使用Trizol试剂（Invitrogen,U.S.A）提取总RNA。使用MMLV-reverse transcriptase（Fermentas，CAN）将其转化为cDNA。用TGF-β1、Krt5引物进行扩增，通过将阈值周期（Ct）值归一化，使用计算公式2-ΔΔCt计算出每个样本中TGF-β1、Krt5的相对mRNA量。基因引物：TGF-β1 Sense primer：5’-CACCATCCATGACATGAACC-3’，Anti-sense primer：5’-TCATGTTGGACAAC TGCTC-3’；Krt5 Sense primer:5’-AGGGCACCAAGACCATAAAGCA-3’，Anti-sense primer：5’-TTCATGTAGGCCGCGTCCAC-3’；GAPDH Sense primer：5’-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3’，Anti-sense:primer:5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。

1.11 统计分析

采用SPSS 13.0软件对数据进行分析，数据以mean±S.D.表示，差异性分析采用t检验或χ2检验，P＜0.05为显著差异，P＜0.01为极显著差异。

2 结果

2.1 Nif改善大鼠牙龈退缩

模型复制15 d后，Nif干预组分别用1 mg/mL和2 mg/mL浓度的Nif凝胶每天两次干预牙龈退缩区域，18 d后，结果显示，模型组牙龈退缩明显，牙根裸露，而Nif干预组牙龈退缩明显减轻（图1.A，箭头所示）。测量结果显示：1 mg/mL自干预6 d起，2 mg/mL自干预3 d起显示明显的治疗效果（与模型组对比，P＜0.01）（图1.B）。

图1 不同浓度的Nif对大鼠退缩程度的干预作用

2.2 Nif可以增加牙龈退缩模型组织含量

为研究牙龈退缩模型组织缺损的改变，采用Micro-CT检测组织形态改变。结果显示，模型组显示组织明显缺损（1.86±0.34 mm2），而1 mg/mL Nif（1.09±0.29 mm2）和2 mg/mL Nif（0.64±0.38 mm2）每天2次干预，18 d可以明显增加牙龈组织含量，与模型组对比，牙龈组织明显增加（P＜0.01）（图2）。

图2 Micro-CT分析大鼠牙龈组织缺损

2.3 Nif可以恢复退缩牙龈组织形态

为进一步分析Nif干预后牙龈退缩模型病理改变，用HE染色和Masson染色分析病理和胶原变化。HE染色结果显示，与空白对照组对比，模型组上皮组织结构分层不清晰，表皮层和真皮层明显变薄，颗粒层和棘层不明显，皮下结缔组织排列紊乱，组织厚度不足。Nif干预后可以明显增加上皮角化层、颗粒层和棘层。2 mg/mL Nif组显示其牙龈组织基本恢复正常。Masson染色结果显示，对照组牙龈组织胶原纤维密集，排列整齐，纤维较长。模型组真皮组织纤维组织排列紊乱，表皮组织纤维缺乏。Nif干预后可以改善纤维排列，增加纤维含量，增加的纤维以表皮层组织为主（图3）。

图3 HE和Masson染色分析大鼠牙龈组织病理改变

2.4 Nif可以增加牙龈组织TGF-β1、Krt5的蛋白和基因表达

为进一步分析牙龈组织胶原纤维类型变化，通过免疫组化检测TGF-β1、Krt5的蛋白改变，用RT-PCR检测其mRNA改变。免疫结果显示，与空白对照组比较，模型组缺损的牙龈上皮的角化层、颗粒层和棘层变薄，其TGF-β1、Krt5的蛋白表达较低。而Nif干预组的牙龈上皮角化层、颗粒层和棘层明显增厚，蛋白表达明显增加。而真皮层和皮下组织表达量差别不大。RT-PCR结果显示，模型组TGF-β1、Krt5的mRNA表达降低，而Nif干预组可以增加mRNA的表达（图4）。

图4 通过免疫组化和Real-Time PCR检测大鼠牙龈组织TGF-β1和Krt5的蛋白和基因改变

3 讨论

牙龈退缩的原因比较复杂，如物理损伤、慢性牙周炎、年龄因素等[9]。本课题通过物理方法复制牙龈组织缺损，加LPS模拟炎症刺激，成功复制了大鼠牙龈退缩模型。本研究初步证实了Nif对大鼠牙龈退缩模型的治疗作用。

牙龈组织变薄和牙槽骨吸收是导致牙龈退缩的根本因素[10]。本研究中，与模型组对比，Nif可以增加牙龈组织含量，恢复缺损的牙龈组织，2 mg/mL Nif干预组牙龈形态基本恢复正常。说明Nif可以恢复退缩的牙龈组织。作为经典的钙通道组织，Nif能够升高牙龈上皮细胞内的游离钙离子浓度，促进细胞的增殖，细胞内游离钙离子浓度的升高可能是钙离子拮抗剂诱导牙龈增生的机制[11]。本研究中，Nif明显增加纤维组织含量，恢复牙龈上皮正常结构，尤其对牙龈上皮的颗粒层和棘层比较明显。颗粒层和棘层是上皮中比较活跃的细胞层，通过分裂增殖修复损伤的牙龈上皮或组织，是维持牙龈正常形态和功能的主要细胞层[12]。本研究的结果提示，Nif对退缩模型的治疗作用主要是通过恢复牙龈上皮颗粒层和棘层的活性来实现的。

TGF-β1可由多种细胞分泌，在调控细胞增殖和分化，在组织生长、修复及细胞外基质合成中发挥重要作用，TGF-β1在牙龈退缩的病理改变中也具有重要作用，通过TGF-β1可促进靶细胞增殖及胶原纤维的合成[13-14]。为进一步研究Nif对牙龈退缩的作用机制，我们检测了TGF-β1的蛋白表达和基因表达，结果显示，Nif可增加牙龈上皮细胞颗粒层和棘层细胞TGF-β1的表达。说明Nif增加上皮细胞TGF-β1的表达是促进牙龈组织修复的重要因素。

角化层对牙龈上皮具有保护作用，牙龈上皮细胞的正常角化也是其功能的重要表现[15]。细胞角蛋白是一组仅见于上皮细胞的中间丝成分,它们又能分为8种Ⅱ型（Krt 1～8）和12种Ⅰ型（Krt 9～20）角蛋白，Krt5是牙龈表皮角蛋白的一种，也是上皮细胞分裂能力和成熟的重要标志[16-17]。通过PCR和免疫组化检测发现，Nif可以增加Krt5的表达，其主要分布在上皮细胞的角化层、颗粒层和棘层，说明Nif有可以促进牙龈上皮修复和成熟的功能。

本研究初步显示，采用Nif持续进行局部干预，可以有效增加退缩的牙龈上皮细胞，恢复牙龈组织正常结构，该作用与促进上皮组织表皮细胞的分裂和增殖、促进上皮细胞角化成熟有关。提示Nif局部应用可以成为有效治疗牙龈退缩的候选药物。