微波辐射预处理提取细风轮菜总黄酮工艺及其含量的季节变化

雷 丽，陈旭波

（丽水学院生态学院，浙江丽水323000）

细风轮菜（Clinopodium gracile（Benth.）Matsum），又名塔花、剪刀草、瘦风轮等，为一年生唇形科风轮菜属草本植物，主要分布于我国的广东、福建、江苏、广西、云南等地[1]，资源十分丰富。细风轮菜作为中药，全草入药，有清热解毒、活血功效，能治疗感冒头痛、中暑腹痛、乳腺炎、痢疾、荨麻疹、呕吐、毒虫咬伤等[2]。

细风轮菜化学成分主要有黄酮类、皂苷类、挥发油、有机酸类、芳香族类、三萜类、甾体类等，其中皂苷类、黄酮类是该植物的主要活性成分[3-7]。研究表明这两种活性成分具有抑菌、抗肿瘤[8-10]、治疗心血管疾病[11-12]等功效。

活性成分的提取是应用的前提，近年来，微波辐射预处理提取在总黄酮提取工艺优化中的效果越来越显著[13-14]。用该方法对细风轮菜三萜皂苷进行提取已有报道[8]，但对细风轮菜总黄酮进行提取并未涉及。另外，药材的有效成分含量与采集时间密切相关，而细风轮菜生长周期较长，丽水本地全年可达10个月左右，而当地人偏向于随时采用。因此，本实验以细风轮菜为原料，采用微波辐射预处理提取细风轮菜总黄酮，研究微波辐射时间、微波功率、汽化剂用量、汽化剂浸润时间、水浴温度、乙醇体积分数、水浴提取时间、料液比等对总黄酮得率的影响，并通过正交试验优化提取工艺。同时，探讨总黄酮含量的季节变化，为细风轮菜的综合利用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本次实验所用细风轮菜于2016年11、12月和2017年3、4月采自浙江省丽水市白云山，晒干粉碎后用石油醚预处理，风干备用。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器

微波炉（Galanz，P70F20CN3P-SR（WO）型）；紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司，UV752）；循环水式多用真空泵（巩义市瑞力仪器设备有限公司，SHZ-95B）；水浴锅（上海珂淮仪器有限公司，Grant SUB AQUA 12 PLUS）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，ME104）；烘箱（上海精宏实验设备有限公司，DHG-9246A）。

1.2.2 主要试剂

芦丁（HPLC≥98%，北京世纪奥科生物技术有限公司）；石油醚（分析纯，60-90，杭州高晶精细化工有限公司）；乙醇（分析纯，杭州双林化工试剂有限公司）；氢氧化钠、硝酸铝（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；亚硝酸钠（浙江省兰溪市化工试剂厂）。

1.3 细风轮菜总黄酮的含量测定

1.3.1 总黄酮标准曲线的绘制

采用硝酸铝显色法[15]绘制总黄酮标准曲线。

1.3.2 微波辐射预处理

精确称取细风轮菜5 g放入玻璃培养皿中，预处理过程参考王赵改[13]等人的方法。将预处理好的样品放入烧杯中，加入一定浓度乙醇溶液，恒温水浴提取，抽滤除渣，得黄酮提取液，待测。

1.3.3 总黄酮含量测定

将细风轮菜总黄酮提取液定容，用移液管取1 mL按照标准曲线测定方法进行显色反应，最后定容至25 mL，测定吸光度，重复3次，取平均值。依据标准曲线方程，求得总黄酮得率。总黄酮得率（mg/g）=，其中X为稀释倍数，Y为提取液体积，Z为提取液总黄酮浓度（mg/mL），W为粉末质量5 g。

1.4 单因素试验

单因素实验因素水平见表1，每个因素至少5个水平。

表1 单因素试验

1.5 正交试验

根据单因素试验结果设计因素水平，对微波辐射时间（A）、微波功率（B）、汽化剂用量（C）、汽化剂浸润时间（D）、水浴温度（E）、乙醇体积分数（F）、水浴提取时间（G）、料液比（H）进行8因素3水平正交试验，因素水平见表2，以细风轮菜总黄酮得率为评价指标，通过L27（38）正交试验确定最佳提取条件，正交表参考表3。

表2 因素水平

1.6 数据处理

试验数据均用Excel 2010和Minitab进行数据分析及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线绘制

芦丁标准曲线如图1。线性回归方程为Y=9.200 9X+0.008 6，R2=0.998 9，具有较好的相关性，表明芦丁在0.2～1.2 mg范围内呈线性关系。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果

以总黄酮得率为纵坐标，各因素水平为横坐标绘制单因素实验折线图（图2～图9），其中细风轮菜春季的总黄酮得率参考左边（Y轴）的主坐标，冬季的参考右边（Y轴）的次坐标。

图2 微波辐射时间对总黄酮得率的影响

2.2.1 微波辐射时间对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃、水浴提取时间30 min，考察微波辐射时间30、60、90、120、150 s对总黄酮得率的影响。由图2可知，随着微波辐射时间的增加，细风轮菜总黄酮得率均先上升，当辐射时间为120 s时，冬季细风轮菜总黄酮得率最高，为45.823±0.315 mg/g；当辐射时间为90 s时，春季细风轮菜总黄酮得率最高，为223.203±1.052 mg/g，随着微波辐射时间的增加，细风轮菜总黄酮得率均下降。

2.2.2 微波功率对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波辐射时间120 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃、水浴提取时间30 min、考察微波功率140、280、420、560、700 W对冬季细风轮菜总黄酮得率的影响。由图3可知，随着微波功率的增加，冬季细风轮菜总黄酮得率先上升，当功率为560 W时，冬季细风轮菜总黄酮得率最高，为45.823±0.315 mg/g。

图3 微波功率对总黄酮得率的影响

汽化剂用量为2 mL、浸润时间5 min、微波辐射时间90 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃、水浴提取时间30 min，考察微波功率对春季细风轮菜总黄酮得率的影响。由图3可知，随着微波功率的增加，春季细风轮菜总黄酮得率先上升后下降，当功率为560 W时，春季细风轮菜总黄酮得率最高，为223.203±1.052 mg/g。

随着微波功率的增大，总黄酮得率均上升，表明需要足够的微波能量破碎细胞结构，促使细风轮菜总黄酮进入溶剂，功率为560 W时，细风轮菜总黄酮得率最高，当微波功率达到700 W时，总黄酮得率均极显著下降（P＜0.01（冬季）；P＜0.01（春季））。

2.2.3 汽化剂用量对总黄酮得率的影响

汽化剂浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间120 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃、水浴提取时间30 min，考察汽化剂用量0、2、4、8、16、24 mL对冬季细风轮菜总黄酮得率的影响，不同汽化剂用量下的总黄酮提取规律见图4。当汽化剂用量为2 mL时，冬季细风轮菜总黄酮得率最高，为45.823±0.315 mg/g；当汽化剂用量为4 mL时黄酮得率最低，仅为39.981±0.307 mg/g。随着汽化剂用量的增加，冬季细风轮菜总黄酮得率再次上升，当汽化剂用量为16 mL以上时冬季细风轮菜总黄酮得率趋于稳定。

图4 汽化剂用量对总黄酮得率的影响

汽化剂浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间90 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃、水浴提取时间30 min，考察汽化剂用量对春季细风轮菜总黄酮得率的影响。由图4可知，随着汽化剂用量的增加，当汽化剂用量为2 mL时，春季细风轮菜总黄酮得率最高，为223.203±1.052 mg/g；当汽化剂用量超过2 mL时，春季细风轮菜总黄酮得率先下降后上升；在汽化剂用量为8 mL时，春季细风轮菜总黄酮得率下降至最低，为210.463±0.634 mg/g；当汽化剂用量为16 mL以上时春季细风轮菜总黄酮得率趋于稳定。

2.2.4 浸润时间对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、微波功率560 W、微波辐射时间120 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃、水浴提取时间30 min，考察汽化剂浸润时间0、5、10、20、40、60 min对冬季细风轮菜总黄酮得率的影响，不同浸润时间下的总黄酮提取规律见图5。当浸润时间为5 min时，冬季细风轮菜总黄酮得率最高，为45.823±0.315 mg/g，随着浸润时间的增加，冬季细风轮菜总黄酮得率逐渐下降。

汽化剂用量2 mL、微波功率560 W、微波辐射时间90 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃、水浴提取时间30 min，考察汽化剂浸润时间对春季细风轮菜总黄酮得率的影响。由图5可知，当浸润时间为5 min时，春季细风轮菜总黄酮得率最高，为223.203±1.052 mg/g，随着浸润时间的增加，春季细风轮菜总黄酮得率逐渐下降。

图5 浸润时间对总黄酮得率的影响

2.2.5 水浴温度对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间120 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴提取时间30 mim，考察水浴温度40、50、60、70、80、90℃对冬季细风轮菜总黄酮得率的影响。如图6所示，随着水浴温度从40℃升高到80℃，总黄酮得率逐渐上升，当水浴温度为80℃时，总黄酮得率为51.272±0.304 mg/g，随后总黄酮得率趋于稳定，90℃时总黄酮得率下降不显著（P＞0.05）。

图6 水浴温度对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间90 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴提取时间30 mim，考察水浴温度对春季细风轮菜总黄酮得率的影响。如图6所示，随着温度的上升，春季细风轮菜总黄酮得率先上升后下降，当水浴温度为60℃时，总黄酮得率最高，为223.203±1.052 mg/g。

2.2.6 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间120 s、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度80℃、水浴提取时间30 mim，考察乙醇体积分数35、45、55、65、75、85、95%对冬季细风轮菜总黄酮得率的影响，见图7。随着乙醇体积分数增加，总黄酮得率先升高后降低，当乙醇体积分数为45%时，总黄酮得率最高，为52.857±0.662 mg/g。

图7 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间90 s、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃、水浴提取时间30 mim，考察乙醇体积分数对春季细风轮菜总黄酮得率影响，见图7。随着乙醇体积分数增加，总黄酮得率先升高后降低，当乙醇体积分数为65%时，总黄酮得率最高，为223.203±1.052 mg/g。

2.2.7 水浴提取时间对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间120 s、乙醇体积分数45%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度80℃，考察水浴提取时间30、60、90、120、180 min对冬季细风轮菜总黄酮得率的影响，见图8。随着水浴时间的增加，总黄酮得率持续升高，在90 min时达到最高，为61.552±3.790 mg/g；水浴提取时间大于90 min之后，总黄酮得率开始下降。

图8 水浴提取时间对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间90 s、乙醇体积分数65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴温度60℃，考察水浴提取时间对春季细风轮菜总黄酮得率的影响，见图8。春季细风轮菜总黄酮得率在30 min时最高，为223.203±1.052 mg/g，随着水浴提取时间的变长，总黄酮得率呈下降趋势。

2.2.8 料液比对总黄酮得率的影响

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间120 s、乙醇体积分数45%、水浴温度80℃、水浴提取时间90 min，考察水浴提取固液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL对冬季细风轮菜总黄酮得率的影响，见图9。由图可知，当料液比从1:10 g/mL增加到1:40 g/mL时，冬季细风轮菜总黄酮得率逐渐增加；当料液比为1:40 g/mL时，总黄酮得率最高，为65.742±0.707 mg/g。

汽化剂用量2 mL、浸润时间5 min、微波功率560 W、微波辐射时间90 s、乙醇体积分数65%、水浴温度60℃、水浴提取时间30 min，考察水浴提取固液比对春季细风轮菜总黄酮得率的影响，见图9。由图可知，当料液比从1:10 g/mL增加到1:40 g/mL时，细风轮菜总黄酮得率逐渐增加；当料液比为1:40 g/mL时，总黄酮得率最高，为227.731±0.384 mg/g。

图9 料液比对总黄酮得率的影响

2.3 正交试验结果及验证实验

以春季细风轮菜为材料，进行正交实验，正交试验结果如表3所示，通过正交实验结果极差分析可知，影响细风轮菜总黄酮得率的因素顺序为：乙醇体积分数＞水浴温度＞汽化剂浸润时间＞水浴时间＞料液比＞微波功率＞微波辐射时间＞汽化剂用量。表4显示乙醇体积和水浴温度对春季细风轮菜总黄酮得率的影响极显著（P＜0.01），汽化剂浸润时间对春季细风轮菜总黄酮的提取率影响显著（P＜0.05），与极差分析提示的主导因素保持一致。综合极差和方差分析得出最佳组合为A2B1C2D1E3F1G3H3，即春季细风轮菜总黄酮的最佳提取条件为微波辐射时间90 s、微波功率420 W、汽化剂用量2 mL、浸润时间0 min、水浴温度70℃、乙醇体积分数55%、水浴提取时间90 min、水浴提取固液比1:50 g/mL。在正交试验最佳条件下，春季细风轮菜总黄酮得率为239.300±0.725 mg/g，显著高于正交试验的所有组别（P＜0.05）。

表3 续表

表3 L27（38）正交试验结果

表4 方差分析

2.4 不同方法提取细风轮菜总黄酮工艺的比较

如表5所示，在正交试验方法最佳条件下，春季细风轮菜总黄酮得率为239.300±0.725 mg/g，传统乙醇提取春季细风轮菜总黄酮得率为227.671±0.286 mg/g，两种提取方法对细风轮菜总黄酮得率差异极显著（P＜0.01）；在单因素试验方法最佳条件下，微波辅助提取冬季细风轮菜总黄酮得率为65.742±0.707 mg/g，传统乙醇提取春冬季细风轮菜总黄酮得率为61.999±0.226 mg/g，两种提取方法对冬季细风轮菜总黄酮得率差异显著（P＜0.01）。

表5 不同提取方法结果比对

3 讨论与结论

微波辐射预处理对植物细胞壁产生了破坏作用，几乎无完整细胞存在。细胞壁破坏严重，这就提高了后续提取的效率，逐渐成为一种理想的植物活性物质提取方法[8,13]。本实验结果表明，微波辐射预处理前后总黄酮得率发生了极显著的改变，进一步验证了微波辐射预处理可以提高活性物质的提取率。

总黄酮得率和各个单因素水平有着密切的关联，由于微波辐射时间过长和微波功率过高，实验中总黄酮得率均出现下降，可能是温度过高导致样品中总黄酮被破坏[16-17]。总黄酮得率在汽化剂用量为2 mL时最高，随着汽化剂用量的增加使得提取体系增大，即粉末受到的微波处理相对减弱，总黄酮得率下降。接着，随着汽化剂用量继续增加，黄酮溶出动力加大，且这种增大的趋势逆转了微波能量被分担的影响，所以黄酮得率有所回升[18]。由结果可知，温度升高有利于黄酮的提取，但温度过高可能会破环黄酮结构，另一方面温度过高会造成溶剂的损失，因此造成总黄酮得率的下降[19]。实验中随着乙醇体积分数的增加，总黄酮得率先上升后下降，可能由于乙醇体积分数越高，对氢键的断裂作用越强，提取率越高；但当乙醇体积分数过高时，产生了较大渗透压，破坏了黄酮结构，另一方面，部分醇溶性有机物质溶解增加，影响总黄酮提取浓度，导致其提取率下降[18,20-21]。延长水浴时间有利于黄酮的提取，但时间过长总黄酮得率下降，一方面与黄酮长时间处于高温状态而被破坏有关；另一方面高温使蛋白质凝固，黄酮不易溶出，同时高分子杂质浸出增加，影响提取物有效含量[22]。实验结果表明，当料液比超过1:40 g/mL时，总黄酮得率下降，这可能是因为乙醇用量过大会增加热负荷，延长了提取时间[23]。

在单因素实验中，不同季节的材料在微波辐射时间和水浴时间这两个因素中表现出了一定的差异。春季材料所需的最佳微波辐射时间和水浴时间均低于冬季材料，这是否与材料总黄酮含量的高低有关，还需进一步验证。

通过试验表明，细风轮菜总黄酮的含量随着季节的变化而变化，春季细风轮菜总黄酮含量明显高于冬季细风轮菜总黄酮含量，春季的最大值达到冬季的5倍左右。这与李瑞雪等[24]研究桑树总黄酮含量变化规律基本一致，不同季节桑叶的总黄酮含量以春季最高。研究结论可以为细风轮菜作为药材收获提供参考，但是，其他活性物质成分积累的变化规律以及活性大小是否与季节变化有关需要进一步确认。