血清miR-124、miR-155联合miR-23检测在超早期脑梗死诊断中的应用价值*

张立娜,王海虹,王适达

河北省保定市第二中心医院:1.老年病科;2神经内2科;3.功能科，河北保定 072750

脑血栓形成是最常见的梗死类型，以动脉粥样硬化所致的脑局灶性梗死及相应神经系统病变，属于临床急症，多发于50岁以上老年人群，且女性发病率高于男性[1]。相关调查显示，饮食不当、糖尿病、高血压、血脂疾病是导致脑梗死发生的主要危险因素，其具有较高的致死、致残风险；临床上将发病6 h以内的脑梗死情况称为超早期脑梗死[2-3]。临床资料显示，在发病后6 h内快速诊断及治疗，对患者预后及生存率提高具有重要作用。因此，早期诊断对患者治疗及预后具有重要意义[4]。相关研究指出，在脑血栓形成过程中，存在分子成分与血流流变学变化。微小RNA(miRNA)能够对基因表达起到调节作用，参与细胞生长、分化等过程，并在不同病理、生理过程中呈现不同的表达，对某些疾病的诊断及预测具有重要意义。同时，相关研究证实，miRNA能够调控血管内皮细胞功能，参与平滑肌细胞转化过程，与血管疾病的发生、发展具有密切联系[5-6]。为探讨miR-124、miR-155、miR-23在超早期脑梗死患者中表达的临床意义，本研究对血清miR-124、miR-155、miR-23水平进行了检测，分析了其对超早期脑梗死诊断和预后的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年2 月至2020年2月在本院接受超早期脑梗死治疗的患者91例作为脑梗死组，同时选取同期在本院体检的91例体检健康者作为体检健康组。脑梗死组中男54例，女37例，年龄47～60岁，平均(53.5±5.5)岁，平均体质量指数(BMI)(25.16±1.27)kg/m2；其中小面积梗死40例、中面积梗死33例、大面积梗死18例(按照PullICino公式计算脑梗死面积，脑梗死面积=π/6×长×宽×CT扫描阳性层数层面；梗死面积<5 cm2为小梗死；梗死面积≥5 cm2且≤10 cm2为中梗死；大梗死面积为>10 cm2)，根据动脉粥样硬化(CAS)斑块性质，分为易损斑块患者53例，稳定斑块患者38例。并根据Rankin量表(MRS)评分评估患者神经损伤程度并分为预后良好组(n=64)及预后不良组(n=27)，MRS评分≤2分表示预后良好，MRS评分3～4分表示预后不良。体检健康组中男51例，女40例，年龄50～61岁，平均(55.5±4.6)岁，BMI(25.31±2.01)kg/m2。所有研究对象一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。对本研究的内容患者及家属均知情并同意，本研究获得本院伦理委员会批准。纳入标准：(1)所有患者均符合中华医学会脑梗死诊断标准[7]；(2)均经过脑部CT、磁共振成像检查证实；(3)患者脑梗死发病时间为6 h以内，且脑梗死为初次发病。排除标准：(1)病历资料不全者；(2)恶性肿瘤患者；(3)合并心、肝、肾等严重系统性疾病；(4)短暂性脑缺血发作或合并脑出血等疾病；(5)患有血液疾病患者。(6)有脑梗死既往史者。

1.2观察指标 抽取所有研究对象住院次日或体检当日空腹静脉血液6 mL，以3 000 r/min离心10 min，静置分离上层血清，于-75 ℃环境下保存待检。实时荧光定量PCR检测miR-124、miR-155、miR-23表达量。提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，逆转录处理后获得cDNA，使用Primer5.0软件设计引物，采用2-ΔΔCt方法计算，内参为U6。设置反转录反应条件：25 ℃ 10 min,40 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min；设置扩增条件:94 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s,35个循环，采用2-ΔΔCt方法计算miR-124、miR-155、miR-23的相对表达水平。miR-124引物序列为上游引物：5′-GCT AAG GCA CGC GGT G-3′，下游引物：5′-GTG CAG GTC CGA GGT-3′。miR-155引物序列为上游引物：5′-CGT TAA TGC TAA TCG TGA TAG-3′,下游引物：5′-GCA GGG TCC GAG GT-3′。miR-23引物序列为上游引物：5′-TCA CAC TAT ATC ACA TTG CCA GG-3′，下游引物：5′-TAT GGT TGT TCT GCT CTC TGT CTC-3′。U6引物序列为上游引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,下游引物：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.3诊断效能分析 对各项检查的灵敏度、特异度和准确度进行统计。灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%。特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%。准确度=(真阳性例数+假阳性例数)/总例数×100%。

1.4统计学处理 采用SPSS21.0统计学软件进行分析。多组间计量资料的比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验;组间比较采用独立样本t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1miR-124、miR-155、miR-23在体检健康组、脑梗死组中的表达水平比较 与体检健康组相比，脑梗死组血清中miR-124表达水平较低，miR-155、miR-23表达水平较高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 miR-124、miR-155、miR-23在体检健康组、脑梗死组中的相对表达水平比较

2.2不同梗死面积、神经缺损程度、CAS斑块性质患者miR-124、miR-155、miR-23表达的水平比较 随梗死面积的增加，miR-124表达水平降低，miR-155、miR-23表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；随神经缺损程度增加，miR-124水平降低，miR-155、miR-23水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与易损斑块患者相比，稳定斑块患者miR-124水平较高，miR-155、miR-23水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同梗死面积、神经缺损程度、CAS斑块性质患者血清miR-124、miR-155、miR-23相对表达水平比较

2.3不同预后状态患者血清miR-124、miR-155、miR-23表达水平比较 与预后良好组相比，预后不良组miR-124表达水平较低、miR-155、miR-23表达水平较高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同预后状态患者血清miR-124、miR-155、miR-23相对表达水平比较

2.44种检测手段灵敏度、特异度及准确度比较 miR-124检测的灵敏度、特异度和准确度分别为71.43%、70.33%、70.87%，miR-155检测的灵敏度、特异度和准确度分别为69.23%、70.33%、69.78%，miR-23检测的灵敏度、特异度和准确度分别为74.72%、79.12%、76.92%，三者联合检测的灵敏度、特异度和准确度分别为95.60%、94.51%、95.05%。与miR-124检测相比，miR-155检测的灵敏度、特异度和准确度略低，miR-23的灵敏度、特异度和准确度略高，但差异无统计学意义(P>0.05)；与miR-124、miR-155、miR-23单独检测相比，三者联合检测的灵敏度、特异度和准确度较高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 4种检测手段灵敏度、特异度及准确度比较(%)

2.5单独检测与联合检测脑梗死多因素Logistic回归分析 单独检测与联合检测脑梗死多因素Logistic回归分析，结果显示血清miR-124异常表达与超早期脑梗死呈负相关关系，血清miR-155、miR-23呈正相关关系。见表5。

表5 单独检测与三者联合检测脑梗死多因素Logistic回归分析

3 讨 论

超早期脑梗死是指发病时间在6 h内的患者，快速确诊治疗，能有效降低并发症及后遗症的发生，是脑梗死治疗的关键，对生存率具有严重的影响[5]。相关研究显示，随着我国人口老龄化加重，脑梗死发病率呈逐年上升趋势，若未及时诊断及接受有效地治疗，导致炎性反应、氧化应激反应等缺血及联病理事件的发生，会严重威胁患者生命健康及生活质量。因此，及时得到有效诊断对患者的治疗及预后具有重要意义[7]。

目前，临床主要通过头颅CT、MRI等影像学手段对脑梗死患者进行诊断，但其诊断准确性欠佳[8]。随着近年来医学技术的发展，RNA诊断在临床众多疾病诊断中得到广泛应用。相关研究显示，miRNA具有组织特异性高、相对稳定性及体液丰度高等特点，能够通过抑制转录、降解miRNA，达到对靶基因转录水平调节作用，介导血管生成、凋亡及氧化应激的目的，可作为潜在性组织损伤生物标志物[9-10]。

作为脑部特异性的miRNA，miR-124在脑部神经发育及调控中枢神经功能中具有重要作用[11]。相关资料显示，miR-124在动物模型中作为缺血性脑损伤标志物。在建模8 h后，miR-124表达升高，脑损伤发生，24 h达到峰值，可在48 h后仍保持高表达水平，通过抑制细胞凋亡、降低炎性反应达到保护神经元及脑部组织目的[12]。说明miR-124可以作为脑梗死早期检测的生物标志物[13]。有研究通过观察缺血性脑卒中小鼠脑部梗死面积发现，miR-124基因与脑梗死体积之间存在密切联系[12]。本研究结果显示，miR-124表达水平的检测对超早期脑梗死患者预后及诊断具有重要意义。

动脉粥样硬化是脑梗死的重要病理基础。相关研究发现，miR-155在内皮细胞过表达与抑制内皮细胞增殖或迁移与再内皮化，导致血管通透性增加，诱发动脉粥样硬化。另外，还会通过扰乱巨噬细胞加剧早期动脉粥样硬化[14]。miR-155作为miRNA家族中的重要一员，不仅对动脉粥样硬化具有重要意义，同时在脑梗死发生后参与血运重建与神经元变性[15]。相关资料表明，miR-155属于多功能miRNA，参与细胞生长、代谢、炎症等多种生物过程，可多角度对脑梗死的发生发展进行调控。在健康人群中miR-155表达明显低于脑梗死患者，miR-155可能是新型脑梗死的生物标志物[16-17]。本研究结果显示，血清miR-155检测对超早期脑梗死诊断及预后判断有重要意义。

miR-23在基因层面参与机体各方面病理进程，成为新的研究热点，其对机体的调节体现在多方面、多组织。相关研究发现，少突胶质细胞发育、髓鞘形成与miR-23表达具有密切关系[18]。miR-23在心血管系统疾病中存在高表达，与心血管疾病的发生发展具有密切联系。本研究结果显示，对血清miR-23水平进行检测对超早期脑梗死预后判断有一定价值。

氧化应激、炎性反应、细胞凋亡导致缺血性脑卒中的病理损伤，造成神经细胞受损。miR-124、miR-155、miR-23通过参与调控过程，对疾病预后造成影响。三者联合检测灵敏度更高、特异度更强，诊断价值更高，3种因子表示不同时段的病理变化，对不同时段的脑梗死具有很好的诊断效能[19]。通过为期1年的随访发现，miR-124、miR-155、miR-23异常表达与患者生存率之间存在密切关联，联合检测结果为阳性患者，病死率明显高于阴性患者。局部微循环在脑梗死后持续恶化诱导神经细胞凋亡，是导致梗死面积变化及神经元损伤的重要病因，同时诱导炎症因子聚集，炎性反应发生，进一步造成脑损伤的加重。相关研究表示，miR-124、miR-155、miR-23可能共同参与整个疾病的生理过程，其表达对炎性反应及细胞凋亡可能造成影响，对患者预后产生重要影响[20]。本文研究结果显示，通过对血清miR-124、miR-155、miR-23进行联合检测，能够对患者预后情况做出有效评估。

综上所述，对血清miR-124、miR-155、miR-23进行联合检测，可有效评估患者的梗死面积、神经受损程度及CAS斑块进行定义，同时对超早期脑梗死诊断及预后提供重要参考价值。