C3-差向异构体测定对评估未成年人体内维生素D贮存的重要性*

何益洋，李园梦，徐 鹏，冯 倩，蒋文强，俸家富△

1.四川省绵阳市中心医院检验科，四川绵阳 621000；2.四川省南充市中心医院检验科，四川南充 637000；3.成都中医药大学医学技术学院，四川成都 610075

维生素D(VitD)是一类脂溶性固醇类衍生物，25羟维生素D[25(OH)D]是主要储存形式，包括25(OH)D2和25(OH)D3(本文简称VitD2和VitD3)[1-2]。VitD2和VitD3分别来源于植物和动物。有研究认为应同时检测VitD2和VitD3以保证两种来源的VitD均能被检出[3]。C3-差向异构体(C3-epi)是VitD2和VitD3在酶作用下形成的同分异构体。因此，评价机体内VitD贮存，仅检测总25(OH)D水平，或仅分别检测VitD2和VitD3是不能准确评价的，尤其是对于未成年受试者，因其肝肾脏功能尚未成熟，导致VitD代谢途径向差向异构体分流[4]。本实验室引入超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)，尝试检测了部分受试者VitD2与VitD3水平，并分析了C3-epi对结果的影响，以期为临床评估未成年人(某些VitD相关性疾病)体内VitD贮存提供可靠的循证依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年6—8月来绵阳市中心医院就诊或健康体检的未成年人(<18岁)1 671例，年龄1个月至16岁，中位年龄12岁。分为健康组(n=1 204)和疾病组(n=467)，疾病组为随机抽取的就诊患儿，包括矮小症134例、呼吸道感染215例、营养不良57例和抽动障碍61例。

1.2样本检测 受试者禁食过夜，于上午10点前，用一次性含分离胶/纤维蛋白酶促凝剂真空采血管(美国BD 公司)采集空腹静脉血约5 mL，轻轻颠倒混匀，静置0.5～1.0 h后，以3 000 r/min 离心10 min，分离血清，-80 ℃条件下保存备用。用JasperTMHPLC液相色谱仪与AB SCIEX Triple QuadTM4500MD型质谱仪串联，检测血清中VitD组分含量。实验所用标准及仪器参数设置：(1)校准品。25(OH)D2(同位素掺入≥98.0%,纯度≥95.0%)、25(OH)D3(≥99.0%,≥95.0%)和3-epi-25(OH)D3-[2H3](≥98.0%,≥98.0%)购自美国IsoSciences MPD化学公司；25(OH)D2-D6和25(OH)D3-D6购自美国Medical isotopes公司，二者丰度和化学纯度都分别为 > 98.0%(atom)D和>99.0%；3-epi-25-(OH)D3购自加拿大Toronto research chemical公司，纯度95.0%。(2)样本处理。向200 μL血清中加入10 μL内标溶液，充分混匀后加入1.0 mL叔丁基甲醚，以13 000 r/min高速离心5 min，吸取上清液800 μL于洁净的埃彭多夫管中，并吹干。然后向残余物中加入100 μL含0.1%甲酸的65.0%甲醇溶液，使之复溶，充分混匀后待测。(3)色谱条件。采用C18色谱柱(Phenomenex，美国)进行样本分离，柱温为40 ℃，流速为0.6 mL/min。流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱。(4)质谱条件。采用APCI离子源进行质谱分析；驻留时间为40 ms；扫描模式采用正离子多反应监测模式(MRM)；VitD2、D6-25(OH)D2、VitD3和D6-25(OH)D3的离子对(母离子/定量子离子)分别为395.3/269.2 m/z、419.3/229.3 m/z、383.3/365.3 m/z和389.3/363.3 m/z；监测VitD2、D6-25(OH)D2、VitD3和D6-25(OH)D3所使用的去簇电压分别为110 V、85 V、130 V和130 V，碰撞能量分别为24 eV、21 eV、16 eV和19 eV。(5)数据采集：色谱图输出用Analyst®MD软件(版本号：1.6.3)，数据处理用MultiquantTMMD软件(版本号：3.0.2)，二者均是AB SCIEX Triple QuadTM4500MD质谱仪(ABI，美国)配套操作系统。

1.3C3-epi分析 随机抽取87例样本，包括健康者24例，不同疾病患者63例。用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法进行3-epi-25(OH)D3，即C3-epi检测。

1.4VitD组分水平的计算 根据液质串联质谱测得的VitD2和VitD3结果，计算出25(OH)D=VitD2+VitD3；由于VitD3是VitD2活性的2～3倍，以最高活性3倍计算，将VitD2折算为VitD3，再加上VitD3的活性，合并为AVitD3。活性VitD3(AVitD3)=VitD2/VitD3+VitD3。

1.5VitD营养状态的评估 根据美国医学研究所(IOM)推荐[5]，VitD营养状态判断标准为≤20 ng/mL为缺乏；20～<30 ng/mL为不足；≥30 ng/mL为充足。

1.6统计学处理 采用SPSS25.0统计学软件进行分析。因本研究的VitD组分水平不服从正态分布，所测结果以M(P25～P75)进行描述。比较健康组与疾病组指标的差异，选择Mann-WhitneyU检验；比较多组间指标的差异，选择Kruskal-WallisH检验，两两比较采用Bonferroni法(即调整α水准法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1受试者血清VitD组分水平 受试者VitD2、VitD3、25(OH)D和AVitD3水平见表1。因本组资料均不呈正态分布，用Mann-WhitneyU检验对健康组和疾病组两组差异进行分析，结果显示，疾病组的血清VitD2水平、血清VitD3水平、25(OH)D水平和AVitD3水平均明显低于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2受试者血清VitD2和VitD3水平 受试者中，VitD2水平从高至低依次为抽动障碍组、健康组、呼吸道感染组、矮小症组和营养不良组，中位值水平分别为1.96、1.91、1.61、1.44 ng/mL 和0.99 ng/mL，组间差异有统计学意义(P<0.05)。经Bonferroni法两两比较，营养不良组血清VitD2水平明显低于健康组和抽动障碍组，差异均有统计学意义(P<0.05)。受试者中，VitD3水平由高至低依次为健康组、呼吸道感染组、营养不良组、矮小症组、抽动障碍组，中值水平依次分别为：29.48、28.48、25.89、25.64、24.73 ng/mL，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。经Bonferroni法两两比较，矮小症组和抽动障碍组血清VitD3水平均明显低于健康组和呼吸道感染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3受试者血清25(OH)D和AVitD3水平 受试者中，25(OH)D水平由高至低依次为健康组、呼吸道感染组、抽动障碍组、矮小症组和营养不良组，见表2，中位值水平分别为34.29、33.21、30.04、28.14、27.51 ng/mL，组间差异有统计学意义(P<0.05)。经Bonferroni法两两比较，矮小症组、营养不良组和抽动障碍组血清25(OH)D水平均明显低于健康组，而且矮小症组血清25(OH)D水平还明显低于呼吸道感染组，差异有统计学意义(P<0.05)。

受试者中，AVitD3水平由高至低依次为健康组、呼吸道感染组、抽动障碍组、矮小症组和营养不良组，中值水平分别为30.91、30.19、26.56、26.47、26.07 ng/mL，组间差异有统计学意义(P<0.05)。经Bonferroni法两两比较，矮小症组和抽动障碍组血清AVitD3水平均明显低于健康组，而且矮小症组血清AVitD3水平还明显低于呼吸道感染组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4C3-epi分析 本研究用同位素稀释质谱法评估了87个血清样本C3-epi水平，通过调整质谱条件和更换色谱柱，实现C3-epi和VitD3色谱峰的有效分离，见图1。结果显示，VitD3和C3-epi分别在3.39 min和3.47 min洗脱，洗脱时间非常接近；同时C3-epi的质谱峰与VitD3密切相关。然后，在引入C3-epi标准品和同位素内标之后，采用正离子条件下多反应监测模式(MRM)，实现对C3-epi同位素内标法定量，见表3。因本组资料均不呈正态分布，用Mann-WhitneyU检验对健康组和疾病组两组差异进行分析，结果显示，随机抽样的血清样本中，疾病组的VitD2、VitD3和25(OH)D水平明显高于健康组，而疾病组的VitD2/VitD3与健康组比较差异无统计学意义(P>0.05)，这些改变均与总体血清样本的改变一致；但是疾病组的血清C3-epi水平明显高于健康组，其与VitD3的比值(即C3-epi/VitD3)在疾病组和健康组间差异无统计学意义(P>0.05)，而其与25(OH)D的比值[即C3-epi/25(OH)D]疾病组低于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：C3-epi的质谱峰与VitD3密切相关，洗脱时间非常接近。VitD3和C3-epi分别在3.39 min和3.47 min洗脱。

2.5受试者体内VitD营养状态 用25(OH)D水平分析本组受试者机体VitD贮存状况，因为是夏季，再加上儿童可能有意识地补充了VitD，从图2可见，65.4%健康组和52.7%疾病组受试者VitD充足，疾病组中VitD充足者比例低于50%的是矮小症(41.8%)和营养不良患者(43.9%)。但是，由于VitD2活性仅是VitD3活性的1/3～1/2，因此将VitD2活性折算为AVitD3水平用于分析后发现，仅健康组(53.2%)和呼吸道感染组(51.2%)有刚过一半的受试者VitD贮存充足，而矮小症(30.6%)和抽动障碍患者(31.2%)中VitD贮存充足者不足1/3，其VitD缺乏或不足超过者分别占69.4%和68.8%。

将本研究受试者VitD营养状况绘成图，按25(OH)D判断，见图2A；按AVitD3判断，见图2B。

注：A为25(OH)D判断；B为AVitD3判断。

3 讨 论

VitD缺乏已成为全球的公共卫生健康问题，越来越多的研究者们对VitD水平的关注已不仅仅局限于营养学，而是对很多疾病的构成比，如心脏病、肾病、肺病、癌症、糖尿病、高血压、精神分裂症和自身免疫性疾病等的发生发展、疗效监测和预后评估的意义都在进行广泛的探索[2,6-11]。但是，鉴于早些年医学实验室VitD检测技术的局限，这些研究多集中在某种疾病与25(OH)D水平关系的层面，而对VitD组分的组成、测定及其与疾病发生发展的相关性，研究报道较少。

本研究用UHPLC-MS/MS技术分析了未成年人中健康受试者和某些种类疾病患者血清VitD组分。疾病组血清VitD2、VitD3和25(OH)D水平均较健康组降低。说明未成年人在疾病发生后可能导致体内VitD水平下降，当然也可能是机体VitD水平较低导致疾病发生。虽然还没能证明VitD是一种抗氧化剂，但VitD能调节多条合成抗氧化物质的细胞通路，对抗活性氧自由基和一氧化氮的氧化作用，防止组织细胞氧化损伤[12]。因此，如若机体内VitD长期维持在较低水平，个体对抗ROS的能力就将下降，组织细胞被氧化损伤的可能性增加，导致疾病发生和发展概率增加。另一方面，大多数疾病都与炎症相关，机体抗炎性反应必然消耗抗氧化剂，这可能就是发生疾病时体内VitD水平降低的原因之一。

由于人体血液中VitD2及其代谢产物与VitD结合蛋白相结合的能力比VitD3低，加之VitD2存在一个非生理代谢形式，且其半衰期较VitD3短，VitD2的生物效力明显低于VitD3，这些因素使得VitD3实际存储VitD的能力要比VitD2高2～3倍[1,13]。因此，生理状态下，机体内VitD3水平远高于VitD2水平，VitD2/VitD3比值极低。受试者因某些不明原因导致体内VitD2水平过高而VitD3却明显降低时，若仅检测血清25(OH)D水平，就可能导致VitD贮存充足的假象。对本组受试者的研究显示，经VitD2向AVitD3折算后，以AVitD3水平再进行体内VitD营养状况评估时，本组受试者中无论健康与否，其VitD中位数水平均有明显下降。这可能就是检测血清VitD浓度时，需检测其组分的真正理由所在，因为只有这样才能正确评价受试者体内VitD营养水平。然而，关于对机体内VitD贮存的评价，现在临床实验室几乎都是使用免疫标记技术(即化学发光法)来检测血清总25(OH)D水平，其结果不仅只是将VitD2与VitD3的生物活性等同，而且还忽视了样本中C3-epi的存在，显然这样的评价方式极为不当甚至是错误的认识，真正能正确评价受试者体内VitD贮存的指标是生物可利用VitD，即AVitD。本研究可见，当不考虑VitD2的生物效力时，许多受试者尚表现为有足够的VitD贮存，但若将各种VitD组分折算为AVitD后，2/3以上疾病患者体内VitD贮存不足或缺乏。

25(OH)D能被25-羟基维生素D3-3-差示酶作用，使VitD3第3个碳原子上的羟基空间位置由3β反转为3α，形成3-epimer-25(OH)D3[14]，即C3-epi。C3-epi与VitD3有着相同分子质量和结构式,仅空间构象不同，但它没有生物活性[14]。因此，相同VitD3水平，如果C3-epi含量高，其实质就是降低了VitD的体内贮存。在儿童，尤其1岁以下婴儿，由于VitD代谢通路尚不成熟，C-3异构化可能是25(OH)D的主要代谢途径之一，所以1岁以下婴儿C3-epi浓度很高[15]。本组健康受试者的分析结果也能进一步证明该结论。因此，儿童尤其是1岁以下婴儿如果不检测C3-epi水平，高估其体内VitD贮存的可能性极大。随着年龄的增长，如果血清C3-epi浓度依然高，可能表明VitD代谢通路成熟较慢。本研究发现当处于疾病状态时，患者C3-epi中位数和区间估计均高于健康受试者，表明某些疾病可能影响了机体内VitD的正常代谢，从而影响了机体的真实VitD贮存水平，这类患者如果不检测C3-epi水平，必将高估体内VitD贮存。此外同VitD3一样，VitD2也存在差向异构化，但因为正常生理状况下甚至在多数疾病状况下，VitD2在人体内的含量远较VitD3低，因此，除研究外，临床上检测VitD2的差向异构体对评价VitD贮存的意义不大。这也是本文不分析VitD2差向异构体的原因。但是，本研究结果发现，C3-epi增加的患者，有VitD2增加的趋势。那么，C3-epi的生成与VitD2水平有无关系？是VitD2促进C3-epi的生成，还是C3-epi增加导致的VitD2适应性增加？VitD2增加是否也意味着其差向异构体增加？这需要作进一步研究。

目前，还没有任何医疗机构或研究单位提供VitD2、VitD3及其比值(VitD2/VitD3)的参考值范围，因为现有临床医生均仅依据25(OH)D水平来评价受试者机体内VitD贮存。分析原因：第一，现有临床实验室所使用的免疫学检测方法尚不能分别检测VitD2和VitD3水平；第二，大多数人认为机体内VitD2水平远低于VitD3水平，VitD2的改变对总的25(OH)D水平影响不大；第三，极少有人关注C3-epi对25(OH)D水平的影响。但是，由于VitD2和VitD3活性不同，以及C3-epi形式的存在，即便相同25(OH)D检测水平，也可能由于VitD2、VitD3和C3-epi的组成不同，从而表现出不同的VitD贮存水平。因此，想要准确评估受试者机体内VitD营养状况，就必须准确测定VitD2、VitD3和C3-epi在内的VitD组分。由此可见，正确选择VitD的检测方法和其必须的组分检测，对正确认识和评估受试者机体内贮存至关重要。

由于受试者体内VitD可能存在C3-epi形式，如果只是检测血清25(OH)D水平，或者只检测VitD2和VitD3水平均会过高估计受试者体内VitD贮存。因此，C3-epi水平检测对准确评价受试者体内VitD贮存极为重要，尤其是1岁以下婴儿和某些疾病患儿。