1株广东鸽源Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定

江小艳，林旭埜

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州 510000；2.海泰达生物科技（广州）有限公司，广东广州 510000）

鸽新城疫（Newcastle Disease），俗称鸽瘟，病原属于副黏病毒科、副黏病毒亚科、禽副黏病毒属的禽Ⅰ型副黏病毒（APMV-Ⅰ），RNA 病毒，病毒基因组排列顺序为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，依次编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶蛋白和大蛋白[1]。PPMV-Ⅰ有血凝活性，中强毒株在体外细胞培养中可在体外成纤维细胞（CEF）中增殖，通过膜融合而感染宿主细胞，出现明显的细胞融合、聚集、死亡脱落等细胞病变（CPE）[2]。本研究对广东省清远市某鸽场里疑似发生鸽瘟的病鸽，采集脑、肝脏、胰脏组织，进行病原分离和鉴定，分析其F、HN 基因的分子特征和基因型，测定各代血凝价及细胞半数感染量，为今后鸽新城疫分子流行病学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料

广东省清远市某鸽养殖场发病的美王鸽，具有严重的神经症状，不停扭颈，泻痢，粪便稀薄呈黄绿色。

1.2 主要试剂

Primer Star 酶，pMD19-T质粒（Takara）；0.25%胰蛋白酶消化液（北京索莱宝科技有限公司）；新生牛血清（内蒙古金源康生物工程有限公司）；MEM 干粉（Gibco）；柱式病毒RNA 提取试剂盒（Magen）；反转录试剂盒（艾科瑞）。

1.3 主要仪器

二氧化碳细胞培养箱（Panasonic）；倒置显微镜（广州粤显光学仪器）；PCR 仪器（Biometra）；全自动凝胶成像分析系统（北京赛智创业科技）；全自动家用型孵化器（德州市维谦孵化设备制造厂）：离心机（湖南可成仪器设备有限公司）。

1.4 实验动物

SPF 种蛋（大华农禽蛋有限公司）。

1.5 实验病料

广东省清远市某鸽养殖场发病的美王鸽，具有严重的神经症状，不停扭颈，泻痢，粪便稀薄呈黄绿色。

1.6 实验方法

1.6.1 病鸽组织处理

将无菌采集的不同组织放于-20℃环境，反复冻融3 次后与灭菌PBS 溶液1:5 研磨，8000g 离心5min，0.22μm 滤器过滤上层清澈液体到灭菌离心管中，存放于-20℃环境。

1.6.2 病毒分离培养和血凝（HA）实验

将分离的鸽的不同组织的处理液接种鸡胚，0.2ml/个。弃去24h 内死亡的胚，每日观察4 次。收集尿囊液做HA 实验，观察死胚有无症状。根据文献[3]，对收集的各代尿囊液用PBS 缓冲液在V 型96 孔板中进行2 倍连续倍比稀释，用1%红细胞悬液进行血凝试验，测定血凝价。

1.6.3 病毒测序和分析

参考GeneBank 中已公布的鸽副黏病毒和鸡新城疫病毒F、HN 基因，分别设计引物。对有血凝现象的尿囊液，用柱状病毒RNA 提取试剂盒提取RNA，扩增的F、HN 基因连接pMD19-T 载体，转化DH5α 感受态，挑取疑似阳性的单菌落，送测。测序结果与GeneBank 中已发表的鸽副黏病毒、新城疫F 基因的核苷酸序列进行同源性分析，并绘制系统进化树。

1.7 1 ～10 代TCID50 测定

1.7.1 制备CEF

去除胚脑、喙、翅膀、爪、内脏后，用灭菌PBS 溶液清洗3 次，剪成1 mm3大小碎块，用PBS清洗碎组织直至上清清澈无血液残留，加入10 ml 0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化组织块约15 min，每3 min 用腕部轻轻转动并观察，直至组织块呈现通透、周围毛绒绒的状态，弃去胰酶液，加入2 ml 含有10% 血清的1×MEM 细胞营养液终止消化，弃去，补加15 ml 细胞营养液，轻轻吹散组织，静置30 s，吸取上层细胞悬液，8 层灭菌纱布过滤，再次补加15 ml 细胞营养液，吹散、过滤，反复吹散、过滤4 次后，台盼蓝染色1 min，计数，制成终浓度为每毫升滤液中含活细胞1×106个，24 h 内接种病毒。

1.7.2 接毒

将每代收集的病毒尿囊液用不含血清的1xMEM作10 倍系列稀释，稀释释至10-1-10-9。弃去96 孔板内细胞营养液，吸取100μl 病毒稀释液到96 孔细胞培养板，空白对照加入100μl 细胞维持液（含有2%血清的1xMEM），每个病毒稀释度做6 个重复，设置4 个空白对照，做好标记，放入细胞培养箱，吸附1h 后，补加100μl 细胞维持液，放到细胞培养箱，每日早晚观察并记录细胞病变，按Reed-Muench 法计算1 ～10 代病毒细胞半数感染量。

2 结果

2.1 临床症状和解剖观察

病鸽临床表现为明显的神经症状，头颈扭曲，拉绿色稀粪，剖检器官可见明显充血。

2.2 病毒分离培养和红细胞凝集试验

接种病毒死亡鸡胚可见明显全身充血，水肿，头颈扭曲症状，对照组鸡胚生长发育正常）。1 ～10代血凝实验结果表明1 ～5 代毒血凝价较低、不稳定（4 ～7log2），6 代以后血凝价稳定在7 ～8log2。

2.3 目的基因的扩增、同源性分析

2.3.1 F、HN 基因扩增及进化树分析

F、HN 基因序列扩增产物，经电泳跑胶后，可见预期大小目的条带。经Lasergene 软件分析显示，F 基因开放阅读框为1662 bp，F 蛋白的裂解位点氨基酸序列为：112R-R-Q-K-R-F117，HN 基因开放阅读框为1716 bp。

2.3.2 同源性分析及遗传进化树绘制

分离株与中国主要流行的鸡源基因Ⅶ型NDV 毒株HA-9-06-Ch 及鸭源NDV10-006 株的F 基因核苷酸序列同源性为86.7%、70%，与疫苗株La Sota、Mukteswar 的同源性分别为83.9%、85.3%，而与鸽 源 的Qinghai/1344/2017、China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 株同源性分别为99.2%、98.8%、98.5%。

分离株PPMV-GDQY与鸽源的Qinghai/1344/2017 株亲缘关系最近，与鸽参考株China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 在进化树上处于同一个分支，属于基因Ⅵ型。

2.4 病毒组织TCID50 测定

图1（A）所示为试验孔，可看见明显的细胞融合、圆缩、聚集、细胞死亡脱落等病变现象；图1（B）所示为对照孔鸡胚成纤维细胞生长情况，细胞贴壁生长，呈长梭形，规则排列。1 ～4 代TCID50分别为：10-6/0.1 ml、10-6.5/0.1 ml、10-7.5/0.1 ml、10-7.8/0.1 ml，5 ～10 代TCID50分别为：10-8.4/0.1 ml、10-8.2/0.1 ml、10-8.59/0.1 ml、10-8.23/0.1 ml、10-8.49/0.1 ml、10-8.4/0.1 ml。

图1 细胞观察

3 讨论

临床观察病鸽具有明显神经症状、腹泻，剖检气管严重充血。从病鸽体内分离到的病毒在鸡胚上生长良好，可以凝集鸡红细胞，F、HN 基因序列分析表明，F 蛋白裂解位点序列为112R-R-Q-KR-F117(112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117)，HN 基 因编码571 个氨基酸，在不含胰酶的原代鸡胚成纤维细胞上健康生长均符合强毒株基因特征。根据F 基因核苷酸序列遗传距离分析，PPMV-GDQY 株与Qinghai/1344/2017 株亲缘关系最近，与鸽参考株China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 同属于一个分支，同源性分别为99.2%、98.8%、98.5%，属于基因Ⅵ型。分离株1 ～5 代血凝价较低、不稳定，传到6 代后，血凝价稳定在7 ～8log2，鸡胚死亡时间集中稳定在60 ～72 h，表明分离株6 代以后的培养情况比较稳定。1 ～4 代TCID50分别为：10-6/0.1 ml、10-6.5/0.1 ml、10-7.5/0.1 ml、10-7.8/0.1 ml，5 ～10 代TCID50分 别 为：10-8.4/0.1 ml、10-8.2/0.1 ml、10-8.59/0.1 ml、10-8.23/0.1 ml、10-8.49/0.1 ml、10-8.4/0.1 ml，表明分离的毒株TCID50较高且5 代以后的分布在10-8.2～10-8.59/0.1 ml。