干扰长链非编码RNA MNX1-AS1对卵巢癌细胞的干样特性、氧化应激以及线粒体功能损伤的影响*

张晓丹 徐 毅 杜德奇 郭 莹 王鲁文

（郑州市妇幼保健院，1 产科，2 妇科，郑州 450000；3 郑州大学第三附属医院妇科，郑州 450000）

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA） 大约占人类基因组的98%，其中，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码序列[1-2]。某些lncRNA在恶性肿瘤组织或细胞系中具有异常表达，可作为早期诊断的参考、临床治疗的靶点或预后的标志，比如NEAT1[3]、HAGLROS[4]、TP73-AS1[5]、VPS9D1-AS1[6]等。通过多种途径参与肿瘤的发生与发展，在细胞的增殖、转移、侵袭、迁移、凋亡等方面发挥作用。因此，lncRNA在肿瘤研究中具有价值和潜力。卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系统恶性肿瘤，5年生存率不超过50%[7]。仅15%患者在早期或局部阶段被诊断，治疗后药物抵抗性及复发率较高[8]，寻找新的生物标志物来协助卵巢癌早期诊断和靶向治疗迫在眉睫。lncRNA在卵巢癌发生和发展中起着促进或抑制作用，干扰lncRNAs的异常表达可有效逆转肿瘤的进展。Han等[9]的研究显示lncRNA SOX2OT在卵巢癌中促进肿瘤细胞增殖和活性，Edward等[10]研究显示干扰lncRNA HOXA11-AS具有抑制上皮性卵巢癌致癌表型的作用，但lncRNA MNX1-AS1对卵巢癌的影响尚未报道。因此，本实验探讨干扰lncRNA MNX1-AS1对卵巢癌细胞的干样特性、氧化应激以及线粒体功能损伤的影响，以期为卵巢癌的临床诊断、治疗提供有价值的参考。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂仪器

人卵巢癌细胞SKOV3购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640培养液、干细胞无血清培养基（MSC Basal Medium）、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美国Thermo Fisher公司）；LipofectamineTM3000转染试剂（武汉普诺赛生命科技有限公司）；阴性对照质粒、沉默表达序列质粒（山东维真生物科技有限公司）；SDS-PAGE蛋白凝胶、RIPA细胞裂解液，TRIzol试剂，PCR试剂盒（南京金斯瑞生物科技有限公司）；总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量测定试剂盒（上海信裕生物技术有限公司）；羊抗鼠OCT4抗体、鼠抗人SOX2抗体、鼠抗人ABCG2抗体（美国Sigma-Aldrich公司）；丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、活性氧（ROS）试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司）；JC-1线粒体膜电位试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。

Rt2100c酶标检测仪（BioTeK美国伯腾仪器公司）；CytoFLEX流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；DMi8倒置荧光显微镜（德国徕卡公司）；BPN-80CRH（uv） CO2恒温培养箱（上海一恒仪器有限公司）；BBS-SSC超净工作台（济南鑫贝西生物技术有限公司）；JIDI-16R台式多用途高速冷冻离心机（广州吉迪仪器有限公司）。

1.2 细胞培养、转染及分组

将SKOV3细胞转移至含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI-1640培养液中，置37℃、5%CO2恒温培养箱内培养，细胞生长达90%以上，消化处理后，调整细胞浓度为1×106/mL，取对数生长期细胞进行实验。

将消化稀释后的SKOV3细胞随机分成5组：对照组、阴性对照组（shRNA-NC）及3个干扰组（MNX1-AS1-shRNA1、MNX1-AS1-shRNA2、MNX1-AS1-shRNA3）。其中，空白组加等体积培养液，其余4组分别使用LipofectamineTM3000转染不同序列质粒，细胞培养48 h 后，进行后续实验。

1.3 RT-PCR检测RNA MNX1-AS1的表达

取方法1.2中转染的对数生长期细胞，经消化、离心、重悬后，稀释为1×106/mL，接种于96孔板，置37 ℃、5% CO2培养箱24 h。采用TRIzol试剂提取细胞样品中的总RNA，进行反转录，加入相应引物。用2-△△Ct法计算RNA MNX1-AS1的相对表达水平。

将生长良好的细胞，进行消化离心，用PBS清洗后转移至干细胞培养基，重悬细胞，并计数，经细胞铺板后，培养10 d，在显微镜下观察成球数量及状态。

1.4 免疫印迹检测干细胞标记物蛋白OCT4、SOX2、ABCG2的表达

取方法1.2中对数生长期细胞，PBS洗涤，加入裂解液，收集上清液。按照BCA试剂盒说明，进行蛋白定量、电泳、转膜、封闭后，选用OCT4、SOX2、ABCG2相应抗体，进行一抗、二抗、显色等操作。

1.5 试剂盒检测氧化应激标记物MDA、SOD的含量

取方法1.2中对数生长期细胞，用PBS重悬细胞，反复冻融3次破坏细胞膜，分别按照MDA、SOD试剂盒说明进行操作。

1.6 荧光探针检测ROS的含量

按照1∶1 000比例用无血清培养液稀释DCFHDA，取方法1.2中收集好的细胞悬浮，稀释为1×106个/mL，置于培养箱中孵育（37℃，20 min），洗涤3次，探针标记完成后，在激发波长503 nm，发射波长530 nm附近，用荧光显微镜进行观察。

1.7 流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化

取方法1.2中收集好的细胞，离心后弃上清，根据线粒体膜电位检测试剂盒说明进行操作，加入JC-1荧光探针染液，置于37℃、5% CO2培养箱20 min，洗去染色液，用流式细胞仪检测。

1.8 免疫印迹检测线粒体损伤标记蛋白Bax/Bcl-2、cleaved cas3、cas3、c-Myc的表达

操作同方法1.4，选用Bax、Bcl-2、cleaved cas3、cas3、c-Myc相应抗体。

1.9 统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件分析，数据用±s表示，行单因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同shRNA序列干扰lncRNA MNX1-AS1表达的影响

与对照组相比，shRNA-NC组RNA MNX1-AS1表达水平差异无统计学意义；与shRNA-NC组相比，3个干扰组RNA MNX1-AS1表达水平均降低（P<0.05，图1），其中MNX1-AS1-shRNA3组干扰最为显著，选择此组为后续实验干扰组。

图1 不同shRNA序列干扰lncRNA MNX1-AS1表达的影响

2.2 干扰lncRNA MNX1-AS1对卵巢癌干细胞成球的影响

与对照组相比，shRNA-NC组干细胞成球差异无统计学意义；与shRNA-NC组相比，MNX1-AS1-shRNA3干扰组细胞成球数量及直径显著减少（P<0.05，图2）。结果提示，干扰lncRNA MNX1-AS1能抑制SKOV3干细胞特性，能够降低肿瘤细胞的自我更新及分化，缓解卵巢癌病程。

图2 各实验组对卵巢癌干细胞成球的影响

2.3 干扰lncRNA MNX1-AS1对卵巢癌干细胞标志物蛋白表达的影响

与对照组相比，shRNA-NC组标志物表达水平差异均无统计学意义；与shRNA-NC组相比，MNX1-AS1-shRNA3干扰组的OCT4、SOX2、ABCG2表达水平均降低（P<0.05，图3）。结果提示，干扰lncRNA MNX1-AS1能抑制SKOV3干细胞特性，在一定程度上缓解卵巢癌病程，与结果2.2的一致。

图3 各实验组对卵巢癌干细胞标志物蛋白表达的影响

2.4 干扰lncRNA MNX1-AS1对卵巢癌细胞线粒体功能的影响

与对照组相比，shRNA-NC组氧化应激标记物水平差异无统计学意义；与shRNA-NC组相比，MNX1-AS1-shRNA3干扰组MDA含量显著升高、SOD活性显著降低（P<0.05，图4A、B，见封三）；MNX1-AS1-shRNA3干扰组细胞荧光强度增强，活性氧水平显著升高（P<0.05，图4C、D，见封三）。实验提示干扰lncRNA MNX1-AS1诱导氧化应激反应增强，促进SKOV3细胞线粒体损伤。

与对照组相比，shRNA-NC组卵巢癌线粒体指标水平差异无统计学意义；与shRNA-NC组相比，MNX1-AS1-shRNA3干扰组红色细胞转向绿色荧光的数目增多，绿色荧光细胞比例较大（P<0.05，图4E、F，见封三），表明线粒体的膜电位下降；MNX1-AS1-shRNA3干扰组Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3表达水平显著增加，c-Myc表达显著降低（P<0.05，图4G、H，见封三）。提示干扰lncRNA MNX1-AS1促进SKOV3细胞线粒体损伤，对卵巢癌有缓解作用。

图4 各实验组对卵巢癌细胞线粒体功能的影响

3 讨论

近年来，肿瘤学领域的研究趋向于分子机制以及分子水平的临床诊断、治疗。其中，lncRNAs被证实与多种恶性肿瘤的生物学功能有关。Chen等[11]的研究表明lncRNA BLACAT1可作为子宫癌诊断和预后的潜在生物标志物。Huang等[12]的研究显示lncRNA PTTG3P通过上调PTTG1和激活PI3K/AKT信号通路促进肿瘤生长和转移，可作为肝癌预后的标志物；Xia等[13]指出二甲双胍可以通过破坏lncRNA MALAT1/miR-142-3p的海绵效应，抑制宫颈癌细胞增殖。

越来越多的lncRNA被发现在卵巢癌细胞中参与基因调控，阻断或促进癌症发展。Zeng等[14]报道lncRNA AB073614的上调可作为上皮性卵巢癌预后的标志因子，并在体内外促进肿瘤生长；余心华等[15]研究表明lncRNA ANRIL靶向miR-214的表达调控卵巢癌细胞的增殖与侵袭行为。本实验探讨干扰lncRNA MNX1-AS1对卵巢癌细胞的干样特性、氧化应激以及线粒体功能损伤的影响。

ABCG2转运蛋白维持干细胞稳定性，SOX2转录因子诱导成体干细胞转化为多功能细胞，OCT4蛋白维持干细胞多样性和自我更新的能力[15]。Wu等[16]报道干扰 lncRNA MALAT1通过增强YAP从细胞核到细胞质的易位来抑制卵巢癌干细胞的干性。结果提示，干扰lncRNA MNX1-AS1能减少干细胞成球数量及直径，降低标志物表达水平，抑制SKOV3干细胞特性，降低肿瘤细胞的自我更新及分化，缓解卵巢癌病程，与上述研究一致。

SOD是重要的抗氧化酶，能够清除超氧自由基[17]。自由基与脂质发生过氧化反应，最终产物是MDA，具有细胞毒性。因此MDA反映膜脂过氧化程度及膜系统损伤程度[18]。通过调节ROS水平，干扰细胞内稳态，促进膜系统受损致使肿瘤细胞程序性死亡，是治疗癌症的有效方法[19]。本实验显示，MNX1-AS1-shRNA3干扰组MDA含量及ROS活性显著升高、SOD活性显著降低，提示干扰lncRNA MNX1-AS1诱导氧化应激反应增强，促进SKOV3细胞线粒体损伤。

当Bax高表达或Bcl-2低表达时线粒体会释放细胞色素c激活凋亡[20]。因此，Bax/Bcl-2不仅是线粒体损伤的指标，也是决定细胞凋亡趋势的标志。此外，活化的caspase 3可促使下游的凋亡相关蛋白活化，进一步破坏线粒体生理结构完整[21]。Liu等[22]的研究显示lncRNA MEG3低表达诱导Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3上调，促使膀胱癌细胞线粒体损伤，促进其凋亡。本实验MNX1-AS1-shRNA3干扰组绿色荧光细胞比例增加，表明线粒体的膜电位下降；Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3表达水平显著增加，c-Myc表达显著降低。提示干扰lncRNA MNX1-AS1促进SKOV3细胞线粒体损伤、诱导其凋亡，对卵巢癌有缓解作用。

综上，干扰lncRNA MNX1-AS1抑制卵巢癌细胞的干样特性，减少肿瘤细胞的自我更新；增加 SKOV3细胞内ROS积聚，降低膜电位，致使线粒体损伤加重，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，干扰lncRNA MNX1-AS1对SKOV3细胞抑制效果显著，具有靶向治疗卵巢癌的潜力。