果蔬保鲜中拮抗菌生物防治研究进展

罗奉奉 ，付 跃 , ，蒋淑娴，何海燕,

（1.河池学院化学与生物工程学院，广西河池 546300；2.微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室，广西河池 546300）

果蔬营养丰富，在人民日常饮食结构中占有重要地位，但果蔬生长、流通和销售常常会受气候与地域限制，果蔬采摘后仍然进行着旺盛的代谢活动，且在采摘、贮藏、运输、加工、销售等环节都可能受到机械损伤、微生物侵染等，致使果蔬腐烂变质。数据显示，我国作为一个水果产量大国，居民主要以鲜食水果为主，水果采后贮藏能力仅为20%左右，远低于发达国家；另外蔬菜采收后粗放的加工和储存方式，也极易造成腐败，因此每年因果蔬采后腐烂造成了巨大的经济损失[1−2]。人们也采用了多种方法应对果蔬采后储存保鲜，然而物理方法防治果蔬病害远远达不到人们所需要的效果，而使用化学杀菌剂控制延缓果蔬的腐烂进程，虽然效果显著，但长期使用会带来诸多问题，如使病原菌产生抗药性、环境污染、化学残留等[3]。生物防治作为一种安全健康的应对果蔬保鲜问题的新途径，受各国研究者重视，其中拮抗菌生物防治安全且对生态发展更友好，成为了果蔬病害防控研究的热点[4−6]。

本文主要针对拮抗菌的作用机制及筛选途径等方面介绍近年来拮抗菌在果蔬保鲜方面的研究进展，旨在加深对拮抗菌在果蔬保鲜研究情况的了解，为未来果蔬保鲜的保鲜剂开发研究提供思路和参考。

1 拮抗菌的作用机理

拮抗菌生防作用机理十分复杂，受诸多因素的影响，涉及到拮抗菌、病原菌和果蔬之间的相互作用，以及果蔬贮藏期间的温度、水分、pH、氧化等因素。大体上拮抗菌的防治保鲜机理有以下几种方式。

1.1 竞争生长

拮抗菌首要作用机理为竞争生长，通过对营养物质（碳水化合物、维生素、氨基酸等）、生长空间（氧气）的有效竞争，使之定植成为优势物种发挥拮抗作用。不同浓度的拮抗菌对病原菌孢子萌发和菌丝生长有不同程度的抑制作用，表明拮抗菌与腐败菌存在营养和空间的竞争[6]；如产黄假单胞菌（Pseudomonas synxantha）DLS65[7]通过竞争营养和空间，明显抑制桃果病原菌（Monilinia fructicola,Monilinia fructigena）菌丝的生长，降低桃果实褐腐病的发病率；拮抗酵母（Sporidiobolus pararoseus）Y16[8]能够在葡萄伤口短时内利用该处营养快速生长繁殖，且在伤口部位形成细胞外多糖基质，占领营养空间，抑制病原菌黑曲霉（Aspergillus niger）的生长；德巴利氏酵母（Debaryomyces hansenii）[9]接种浓度在1×106CFU·mL−1时，与病原菌形成营养竞争，其对蔗糖、葡萄糖、果糖等碳水化合物利用效率更高，使番木瓜的炭疽病发病率下降了50%；Yu 等[10]鉴定了与营养竞争相关的基因，该基因来自于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）JBC17，其在营养胁迫条件下通过产生外切聚磷酸酶和氨基肽酶竞争氮源，从而抑制柑橘青霉病菌（Penicillium digitatum）分生孢子的萌发。由此看出，拮抗菌通过营养物质的摄取占据的优势可在一定程度上抑制致病菌的侵害，在空间竞争中，可快速生长或形成胞外多糖的优势，可促进粘附到果实表面形成生物膜，比病原体更有效地利用有限的资源，是果蔬保鲜中为最为常见的微生物拮抗方式。

1.2 产生铁载体

在微量营养素中，铁（Fe3+）是病原菌生长和发病的关键元素，铁几乎对所有微生物的增长至关重要。而铁载体是一种低分子量的化合物，能够与铁离子（Fe3+）形成紧密而稳定的复合物，在细胞膜上运输铁。拮抗菌通过生产铁载体来竞争铁和干扰病原菌的萌发、生长，可达到对病原的抑制作用[7,11]。如棘胞木霉（Trichoderma asperellum）BHU P-1 和苍白杆菌属（Ochrobactrumsp.）BHU PB-1 生产的铁载体改善了由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici）引起番茄枯萎病[12]，紫色链霉菌（Streptomyces violaceusniger）AC12AB[13]在抵抗马铃薯疮痂病中通过产生铁载体可有效地降低病害严重程度和促进植物生长，Konsue 等[14]发现孢圆酵母（Torulaspora indica）DMKU-RP31、DMKU-RP35 和Pseudozyma hubeiensisYE-21 能够对由色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引起的芒果腐败，及Papiliotrema aspenensisDMKUSP67 对盘长孢状刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）引起的芒果炭疽病起良好的拮抗作用，其中，这四种拮抗酵母均不同程度地产生铁载体对抗这两种真菌病原体。由此看出，拮抗菌产生铁载体对铁的消耗，使病原体产生对铁缺乏的一系列生理应答，最终生长被抑制。

1.3 诱导防御酶

果蔬采摘后极易被病原感染，一些拮抗菌通过定殖诱导果蔬产防御相关酶或化合物等增强抗性，如Waewthongrak 等[15]的研究表明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ABS-S14 能诱导柑橘黄皮组织中防御相关酶——过氧化物酶（POX）和l-苯丙氨酸解氨酶（PAL），两种酶的积累防止指状青霉（Penicilium digitatumSacc.）的侵染；解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）[16]刺激提升苹果果实组织中的多酚氧化酶、过氧化物酶、几丁质酶和L-苯丙氨酸解氨酶的活性，经蛋白质组学和转录组学分析得出，共有35 种蛋白质在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）诱导下表达上调和下调，水杨酸（SA）与乙烯/茉莉酸（ET/JA）信号通路介导的防御反应相关基因表达增加，从而增强苹果果实组织的防御反应；锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）Y16[8]能够能够在葡萄伤口或葡萄表面快速存活和增殖，促使酶相关基因表达，包括多酚氧化酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸脱氨酶等，增强葡萄的抗氧化能力，保护宿主组织免受病原的氧化损伤。由此看出，一些拮抗菌的定殖可增强果蔬抵御病原的能力，通过诱导果蔬防御相关基因表达和增强酶活性，达到一定的生物防治作用。

1.4 形成生物膜

拮抗菌能够成功定殖在果蔬表面或伤口处并进行繁殖，大多数情况依赖于微生物拮抗群体形成的以多糖、核酸、蛋白质为主要成分的水化膜[6]。酵母的生物膜拮抗研究中报道较多，Silvana 等[17]研究的白冬孢酵母（Leucosporidium scottii）At17、Liu 等[18]报道的柠檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）34-9 均有产生生物膜的特性，能够在果实或伤口处形成与病原菌隔离的屏障，其作用机制与果蔬所处的环境因素如低温或某些化学物质（芳香醇等）的胁迫诱导有关，触发拮抗菌粘附基因的表达，不同种类的酵母携带不同家族的黏附素，通过特异性细胞壁黏附糖磷脂肌醇（GPI）锚定蛋白介导，促使细胞识别、粘附、入侵和生物膜形成，对采后果蔬病害具有良好的防治效果。

1.5 分泌酶或挥发性化合物

拮抗菌通过寄生或分泌挥发性化合物等对致病菌产生影响，致其细胞畸变破裂而将其杀死。冯金龙等[19]用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）S27 处理马铃薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）、马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani）、马铃薯枯萎病菌（Fusarium tricinctum）后，通过显微观察，发现病原菌菌丝细胞出现不同程度的肿胀、膨大，形成泡状物最后崩解，说明S27 对病原菌菌丝具有致畸、溶解等作用；Yang 等[20]的研究首次发现链霉菌属（Streptomycessp.）产生的一种新的抗真菌素霉素N2 通过诱导活性氧类（ROS）的过量生成，对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）造成严重的氧化损伤，且在一定浓度范围内能显著提高立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）菌丝内的几丁质酶活性，诱导该菌细胞壁降解，从而导致病菌形态发生和自溶。另外，绿色木霉菌（Trichoderma virens）Tv-1 和Tv-2、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）Thz-2、钩状木霉（Trichoderma hamatum）Tha-1[21]通过破坏辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的细胞壁结构、增强脂质过氧化及降低致病因子酶活力等方式起拮抗作用，抑制率均达到90%以上，通过检测丙二醛含量（反映膜脂过氧化的程度，考察细胞受胁迫严重程度的重要参数）、纤维素酶活力等判定木霉菌的杀菌机理；中间假丝酵母（Candida intermedia）C410[22]产生的49 种挥发性物质（酯类、醇类、烯烃类、烷烃类、有机酸类等）中乙酸乙酯、己酸乙酯等对草莓病原灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）分生孢子萌发和菌丝生长均有高度的抑制作用，灰霉病的发生率和严重程度明显降低；绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）JS29[23]产生的生物表面活性剂在不同贮藏条件下均能有效抑制辣椒炭疽菌（Colletotrichumcapsici）的孢子和菌丝的生长；芽孢杆菌（Bacillussp.）对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）[24]、苹果炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum acutatum）[25]、番茄灰霉病（Botrytis cinerea）[26]、桃褐腐病（Monilinia fructicola）[27]等病原菌的生长均具有抑制作用，拮抗作用与芽孢杆菌产氰化氢、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶、真菌代谢物或挥发性物质等有关。拮抗菌对病原的抑制或杀灭作用，一方面可通过分泌一些酶如几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶等破坏病原菌细胞壁结构，影响孢子萌发、菌丝生长；另一方面通过分泌抗生素、挥发性化合物或表面活性剂等促使病原菌细胞内部氧化，产生过量氧化产物，致使细胞损伤达到杀菌的目的。

1.6 防御基因表达

膜醭毕赤酵母（Pichia membranefaciens）[28]对桃树根霉病的生防效果除了可诱导防御相关酶的活性，还可激活防御基因的表达，经转录组分析表明，MAPK 级联信号通路和乙烯（ET）、茉莉酸酯（JA）和水杨酸（SA）的信号转导通路可被拮抗酵母激活，介导下游防御相关基因包括PR 基因和谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因（即植物-病原体相互作用途径和次生代谢物合成相关基因）的表达，提高桃的抗病能力。Muccilli 等[29]构建了表达几丁质酶基因（chit42）的E23 转基因柠檬，对柠檬采后灰霉病（Botrytis cinerea）有很好的抑制效果，代谢组学研究发现其与野生型克隆代谢特征有实质等效性，同时避免了化学杀菌剂的残留和提高食品安全性，该研究证实了基因工程为柑橘特定病害的可持续有效管理开辟了新的前景。淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）[30]gCLA4 中坏死诱导蛋白（necrosis-inducing protein）4955 基因经克隆表达后，检测其对烟草防御反应相关酶活和防御相关基因表达量的影响，发现该蛋白确实能够提高烟草相关防御基因的表达，增强植物的防御反应。新的生物技术工具的发展，开启了更精确、更快速的植物遗传修饰的可能性[31]，不仅改良木本果树品种的特定性状，同时保持选定品种的一般性状不变，保证了果树及产品的理想品种，特别在生物防治病害方面，大大降低了果实采后的保鲜处理难题。

2 拮抗菌的筛选途径

拮抗菌来源途径较为广泛，可以从根际土壤、果蔬根茎、叶子、果实等筛选分离，也可从一些极端环境中筛选，筛选具有高效拮抗力的菌株对果蔬采后病害控制至关重要。但拮抗菌筛选要尽量满足两个条件：一是果蔬所含内生菌中的优势种或寄生效果良好；二要对保护的果蔬无不良影响。

2.1 植物体内生菌的筛选

植物内生菌对果蔬无毒无害、与其互利共生，因此已被大量研究证实植株体内生菌可用于生防[32]。以祁连山东部小嵩草分离出内生的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）262AG6[33]对马铃薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）的抑制率达到81.33%；从番茄植株的根、茎、叶和果实分离的内生菌BL1、BT5、BR8 和BF11 菌株[34]，用其对灰霉病病原真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）进行拮抗试验，发现4 株内生菌抑菌活性为27%～53%，经16S rDNA 测序表明该4 株内生菌与芽孢杆菌亲缘并能分泌大量脂肽和多种抗生素，对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）具有良好的拮抗作用，可用于植物病害的生物防治；从柑桔果实、花、叶中分离得到78 株酵母菌中[35]，经体外抗真菌活性测定，有16 株菌对指状青霉（Penicilium digitatum）具有拮抗作用，15 株菌对柑桔绿霉病具有较强的生物防治能力，其中一株毕赤酵母属菌株（Pichia galeiformis）BAF03 产生的8 种挥发性有机化合物对指状青霉有明显的抑制作用，对柑橘采后绿霉病具有一定的防治作用。

2.2 植物体表微生物的筛选

植物体表是病原菌入侵第一站，某些植物体叶、茎、根、果表面存在一些共生菌或互惠菌帮助植株抵御病原菌。根系表面微生物与根系内生菌不同，其直接接触土壤与植物根表组织，常常定殖于根表形成保护膜，与内生菌相比更易分离得到。从芒果叶片和果实表面分离到GB28 菌株[36]使芒果采后自然感染胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）发病率降低70%；苹果果皮分离的嗜油假丝酵母（Candida oleophila）L-06[37]产生的β-1,3-葡聚糖酶对苹果采后扩展青霉（Penicillium expansum）的分生孢子萌发有抑制作用；Kasfi 等[38]从葡萄表面筛选并鉴定出5 株酵母菌和2 株芽孢杆菌，包括膜状假丝酵母（Candida membranifasciens）等，对葡萄果实积累的黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和褐黄曲霉菌（Aspergillus ochraceus）均有拮抗作用。这些在植物体表面筛选得到的拮抗菌均对本身的果实腐败有一定的防治效果，但也有些拮抗菌的拮抗谱不局限于对本身果实的病原起拮抗作用，对其他果蔬病原也产生拮抗，如在中国北方采集的李子果实表面分离出的新种假丝酵母（Candida prunispnov.）[39]可以防治油桃果实上的褐腐病菌（Moniliniaspp.）引起的褐腐病，使褐腐病发生率降低到20%。

2.3 其他生境拮抗菌的筛选

除了从植株本身可筛选获得拮抗菌，冻土、沼泽、海洋等也可以成为获得拮抗菌的筛选来源，且筛选得到的拮抗菌生防效果不亚于果蔬植株来源。Silvana 等[17]从南极土壤中筛选得到一株耐冷酵母（Leucosporidium scottii）At17，对苹果冷藏储存发生的青霉病（Penicillium expansum）、灰霉病（Botrytis cinerea）有较好的防治效果，发病率下降分别至5%和3%（对照组发病率为99%）；Shen 等[40]在漳州红树林沼泽的泥中分离到一株掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）ZMY-1，当细胞浓度达到1×108CFU·mL−1时，对草莓灰霉病（B.cinerea）有明显的抑制作用，在20 ℃ 和4 ℃ 条件下都能在伤口和草莓果实表面存活和生长，减少了贮藏过程中的自然腐烂且不影响果品；Wang 等[41]从中国东海中筛选得到的海洋红酵母（Rhodosporidium paludigenum）在盐胁迫浓度为6.6%情况下对梨的扩展青霉（Penicillium expansum）抑制最大，其存活率可能与海藻糖积累有关，得出一定的生理诱导使细胞在冷冻后仍表现更好的活力。除自然环境，在一些特定的与动植物生长相关的体内外环境中也可筛选得到拮抗菌，如Kim 等[42]从盐生植物的根际区分离得到枯草杆菌（Bacillus subtilis）HM1 对苹果炭疽病病原体尖锐炭疽菌（Colletotrichum acutatum）造成的病害降低了80.7%，经鉴定，HM1 产生的风霉素化合物在抗真菌活性中起着关键作用；另有从青藏高原传统牦牛发酵乳中分离得到的保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）F17 和乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）H52[43]显著抑制需氧中温菌、酵母菌、霉菌和大肠菌群的生长和定殖，具有促进草莓生物保鲜的潜力；从海洋鱼肠道分离出的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）S2-6、米酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）B2-4[44]对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、志贺氏菌（Shigella）等病原有不同程度的抑制作用，与其分泌的细菌素有关。

从上述可看出，果蔬植株与其体内、体表及周边环境的拮抗微生物共存，成为拮抗菌的筛选良好途径，但在一些特殊的环境中也可获得发挥一定拮抗效力的拮抗菌，对病原作用效果也很明显，开拓了果蔬拮抗菌的筛选来源。

3 常见拮抗菌在果蔬保鲜中的应用

3.1 细菌

芽孢杆菌是具有许多特殊功能的重要的资源微生物，可用于防治植物病虫害、净化水质、改善土壤环境、医学科学及工农业等领域。研究发现其中有一些具有良好防控效果的果蔬保鲜拮抗芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillis）[45−49]、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacien）[50−55]、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）[25,32,56]、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）[57]、苏云金芽抱杆菌（Bacillus thuringiensis）[58−59]等。芽孢杆菌代谢分泌的细菌素物质、脂肽类化合物、溶菌酶蛋白、有机酸类物质等能有效抑制病原菌的生长，或将致病菌溶解从而杀死致病菌及高抗重茬。

另有，假单胞菌属拮抗菌的研究也有一定的成效，如嗜根寡养单胞菌（Stenophomonas rhizophila）能够通过挥发性物质、营养竞争等抑制芒果炭疽病孢子的萌发[60]，可使炭疽病的发病率降低95%；荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）Pf1[61]能够诱导芒果产生防御相关酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（PO）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）等，阻止病原菌在芒果果实中进一步入侵，防止果实贮藏期间腐烂；荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）ZX[62]有蛋白酶活性,产生具有抗真菌能力的铁载体和挥发性有机化合物，可显著减少柑橘青霉病灶的大小和发生率；Oniel 等[63]筛选的一种假单胞菌属（Pseudomonasspp.），从中分离出抗真菌化合物对蓝莓上的灰霉菌（Botrytis cinerea）和链格孢属（Alternaria alternata）产生抑制，使蓝莓果实腐烂发生率和严重度分别降低50%和64%；绿针假单胞菌（Pseudomonas choloeaphtis）HL5-4[64]抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的菌丝生长和分生孢子萌发，萌发抑制率为70.74%，对番茄果实防治效果分别达到72.36%；还有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）UFB2 对番茄溃疡病致病菌密氏克拉杆菌（Clavibacter michiganensis）1-07 有良好抑制作用，基因组分析其有多个基因岛编码次生代谢物如2，4-二乙酰基间苯三酚与抗菌活性相关[65−66]；以及铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）BTLbbc-05[67]抑制辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的孢子囊形成和游动孢子发生，导致游动孢子停止裂解达50%，为潜在的辣椒生防菌。由此看出，此类细菌拮抗菌同样通过产生代谢物、挥发性化合物及诱导产生防御相关酶等方式对果蔬病原菌产生了明显的抑制作用，在果蔬的生物防治中也有较好的开发应用潜力。

此外，乳酸菌是一种在肉、奶、蔬菜和鱼的天然微生物群中发现的细菌，它在食品中安全使用已有很长的历史，被美国食品和药物管理局公认为是安全的（GRAS）。Fang 等[68]研究保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）F17 对葡萄灰霉病有良好的抑制作用，可能与这两种乳酸菌产生的低分子量化合物（有机酸、过氧化氢、胞外多糖、细菌素等）有关，同时菌株有良好的抗氧化能力，抑制了葡萄氧化酶的活性，使茎褐变减少，延缓了葡萄的成熟和衰老；Khodaei[69]研究以羧甲基纤维素（CMC）为载体的可食性涂膜通过添加不同量的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）检测对新鲜草莓的保鲜效果，发现负载植物乳杆菌的草莓减少了表面酵母和霉菌的生长；同样，植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）LH-B02[70]悬浮液（1.44×1011CFU·L−1）喷洒在莲藕表面，不仅色泽损失明显降低，15 d 贮藏期莲藕的硬度、咀嚼性、弹性和粘结性等质地特性显著提高，表明乳酸菌可以改善莲藕的贮藏性能；弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）与2% 瓜尔豆胶处理的番石榴在抗氧化剂含量（6.68 mg TE·g−1）、抗坏血酸含量（125.40 mg·100 g−1）均高于对照组（5.91 mg TE·g−1）、（101.59 mg·100 g−1），延长了番石榴的贮藏期[71]。在此看来关于乳杆菌的拮抗研究已和相关载体联合使用均在不同程度上提升果蔬的抗氧化能力，起到了良好的保鲜果蔬的作用。表1 列出了部分具有代表性的细菌拮抗菌株在果蔬上的防控病害研究情况。

表1 部分具有代表性的细菌拮抗菌在果蔬上的防控病害研究情况Table 1 Partially representative bacterial antagonists used for management of postharvest diseases on fruits and vegetables

3.2 真菌

拮抗酵母是一类使用较为广泛的生防真菌，具有快速繁殖和较强的适应性等优点，成为了水果保鲜研究的焦点之一，季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）[72−74]、柠檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）[54,75]、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）[76−79]、梅奇酵母（Metschnikowia）[80−81]、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）[82−83]、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）[84−85]等均有较多的报道，拮抗酵母的主要优势是在植株或果实上定殖快，形成生长优势，产生的胞外多糖提高了它们的生存能力，并阻断了病原体的繁殖；产生的次级代谢物更具有生态优势，且其能联合其他抗菌剂使用等，这些特征均使酵母起到良好的拮抗效果[6]。部分木霉属也可用作生防微生物，其生物防治活性是由于其竞争营养物质、分泌抗真菌化合物、寄生和激活寄主果实的系统抗性等，目前已报道的果蔬拮抗木霉有：绿色木霉（Trichoderma virens）[21,86−87]、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）[32,88−91]、深绿木霉（Trichoderma atroviride）[92−93]、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）[21,94−95]、钩状木霉（Trichoderma hamatum）[21,96]等，以及一些突变株，如通过γ射线诱变[97]或基因改造[98]的哈茨木霉（Trichoderma harzianum），其几丁质酶酶活性显著提高，增强了木霉对病原菌的生防效果。表2 列出了部分具有代表性的真菌拮抗菌株在果蔬上的防控病害研究情况。

表2 部分具有代表性的真菌拮抗菌在果蔬上的防控病害研究情况Table 2 Partially representative fungal antagonists used for management of postharvest diseases on fruits and vegetables

3.3 放线菌

链霉菌属种众多且常产生各种抗生素，如多抗霉素、四环霉素、雷弗霉素A 等而被广泛利用。已有研究表明，链霉菌属（Streptomycessp.）对黄瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）具极强抗性，抑菌率达82.50%[99]；对葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、西瓜枯萎病菌（Fusarrium oxysporumf.sp.niveum）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、莴苣菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等均有较强的抑制作用[100]，抑菌率分别为94.55%、63.17%、83.58%、76.66%。淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）Xjy[101]在苹果果实中的保鲜应用实验中显示其阻碍了轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）坏死病灶的扩展；球孢链霉菌（Streptomyces globisporus）JK-1[102]对柑橘的青霉病菌（Penicillium italicum）有良好抑制作用，主要是产生的挥发性物质具有抗真菌活性，其中苯乙酮体外抑菌效果最佳。链霉菌属具有的抗真菌作用也体现在产生代谢物抑制菌丝生长，如紫色链霉菌（Streptomyces violaceusniger）AC12AB[103]产生的阿扎霉素RS-22A 显著降低了马铃薯疮痂病发生率达90%；灰色链霉菌（Streptomyces griseus）H7602[104]分泌的1-吡咯-2-羧酸（PCA）对辣椒疫霉（P.capsici）有明显的拮抗作用；浅紫链霉菌（Streptomyces violascens）MT7[105]产生的胞外代谢物对柑橘、番木瓜等多种采后病原真菌具有广谱抗菌活性。表3 列出了部分具有代表性的放线菌拮抗菌株在果蔬上的防控病害研究情况。

表3 部分具有代表性的放线菌拮抗菌在果蔬上的防控病害研究情况Table 3 Partially representative antagonistic actinomycetes used for management of postharvest diseases on fruits and vegetables

由以上统计可看出，细菌、真菌和放线菌的拮抗菌研究已广泛在各类果蔬上有所成效，大部分拮抗菌通过代谢物的分泌抑制致病菌的生长，有些拮抗菌对一种或多种致病菌有良好的拮抗作用，因此，在果蔬保鲜上拮抗菌的生物防治有较为广阔的开发潜力。

4 展望

自然界中微生物资源丰富，在果蔬采后病害控制过程中，拮抗菌做生物防治是目前最有应用前景的，但现研究筛选出应用于果蔬保鲜中的拮抗菌并不多，更多的拮抗菌种类及使用方式尚待人类去开发和利用。现研究的拮抗菌的主要作用机制是通过果蔬的寄生，营养竞争，诱导系统抗性，生产抗生素、水解酶、毒素、挥发性化合物及形成生物膜等多种机制防御病原，研究的种类从原核微生物到真核微生物，均有不同程度地对常见果蔬起到良好的拮抗作用，在实验室体外研究到拮抗菌的应用保鲜检测，都有一定程度地改善果蔬存储效果。但目前拮抗菌生物防治剂多处于研发阶段，成果转化和应用率仍然较低[107]，一方面拮抗菌的有效保鲜成分的提取和纯化都不够精细，且其抵御病原机制往往为多机制作用效果，以单一拮抗机制的抑制效果相对不高；另一方面微生物拮抗菌受果蔬基体环境如温度、水分、酶活及其他成分的影响，其在果蔬保鲜应用中抑菌活性不太稳定。另外在大多数情况下，生物防治系统存在着与商业条件下的性能差异，在于对拮抗菌作用机制的了解不够透彻，在基因和生理上操纵相关拮抗剂的激发子或效应子的信息仍然缺乏等。因此尽管拮抗菌能够控制采后果蔬的腐坏，但仅使用拮抗菌通常不足以达到持续的高腐坏（>95%）的疾病控制[6]，拮抗菌单独使用和单独的物理或化学试剂在果蔬采后的保鲜使用效果往往不尽如意，也限制了拮抗菌的使用，如今在研究拮抗菌应用的有效方法之一是将拮抗菌联合或与一些物理条件或化学试剂配合的情况下，增强果蔬的生防效果。如物理联合拮抗，热空气和拮抗酵母菌（Pichia guilliermondii）联合处理能有效地抑制苹果采后灰霉病[108]、桃子采后青霉（Penicillium expansum）和匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起的病害[72]，提高了果实的抗氧化酶活性和总酚含量，保持采后的鲜度。化学方法联合拮抗，1.5% w/v的磷脂酰胆碱能显著改善葡萄有孢汉逊酵母（Hansenias-pora uvarum）Y3 族群动态，抑制柑桔伤口绿霉病菌的孢子萌发和菌丝生长，且不损害柑桔采后品质[109]；洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）B23 以壳聚糖（0.75%）和氯化钙（3%）为增效剂，对番木瓜炭疽病的防治效果最佳且不影响果实的品质[110]；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）A7+百里香油（100 μL·L−1）对草莓果实灰霉病（Botrytisspp.）的防治效果显著[111]。菌体复合联用拮抗，汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）Y-1 与萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）TE-7 复合使用使芒果氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、β-1,3-葡聚糖活力增强，显著提高采后芒果的贮藏品质，增强果实的抗病性[112]；汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和寡养假单胞菌（Stenophomonas rhizophila）混合培养对甜瓜果实的增殖镰刀菌（Fusarium proliferatum）的发生率和病斑直径有显著抑制作用，与拮抗菌营养竞争、产生的水解酶及次级代谢物有关[113]。因此在拮抗菌单独使用的局限性情况下，考虑复合应用起到一定的互补或协同效应,从而提高了生物防治方法的整体性能和疗效。

如今，也有一些研究者从基因水平开发拮抗菌的拮抗效力，如控制果蔬成熟的某些化合物（乙烯）的生物合成，即影响该化合物合成的关键基因的表达[114]，延缓果实成熟，延长保鲜期；或从病原菌出发，通过同源重组蛋白功能性灭活，使基因表达谱发生改变[115]，影响与细胞壁降解酶活性、糖类和氨基酸代谢、分生孢子形成和多种代谢过程相关的基因的表达，从而使病原菌不能诱导果蔬发病腐烂等。特别是近年来分子技术的应用取得了显著进展，有助于开发创新工具，包括基因组学、宏基因组学、比较基因组学、功能基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以剖析拮抗剂、病原体、果蔬寄主、自然微生物区系和环境条件之间的复杂相互作用。如从基因分子水平上研究，一方面通过克隆拮抗菌中相关拮抗蛋白基因，其产物作用于果蔬植株以激活或增加植株的相关防御基因表达，提高植株的抵御病害的能力；另一方面从水果和蔬菜中的生物活性物质出发，通过果蔬采后储藏处理技术可以减少活性物质的降解或者促进其积累[116]，不少研究者通过转录组学、代谢组学分析，快速鉴定地方品种或野生品种的关键基因或基因簇，甚至建立“基因库”[117]，提高果蔬生物活性物质的含量，包括多酚、类胡萝卜素、维生素等，对产品质量的改善和采前采后的管理非常有用。这或将为未来新型保鲜剂的开发提供思路。

总体来说，采后生物拮抗剂的商业应用非常有限，只占潜在市场的很小一部分。但对化学杀菌剂替代品的需求仍然存在，微生物拮抗产品的前景仍然很有希望。复杂的作用方式使得拮抗性能和功效更依赖于生产、配方、包装、应用和储存。利用先进技术可以确定在批量生产、配方和贮藏期间生物防治基因表达水平的变化、微生物生物防治剂的生理状态以及各种环境胁迫对其胞内机制的影响等，都有可能提高研究者对果蔬采后病原体的微生物控制的理解和认识，随着科技发展，先进的设备和技术将为微生物拮抗剂的研发带来机遇。我国拮抗菌保鲜技术的开发和应用仍然任重道远，更深层次地挖掘和发展高效用、高安全及生态友好的应用于果蔬保鲜的生物农药，将是未来研究的一个重要方向，且在采后生物防治系统、大规模繁殖和商业规模配制微生物拮抗剂方法的研发也是拮抗菌研究领域的一项重大挑战。