多元复合抗性淀粉对高糖高脂模型小鼠代谢调节作用及机制

陈彦君，刘家宏，张 翔，崔敬爱，陈晓平

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118）

饮食结构和人体健康有着非常紧密的联系，高血糖、高血脂、结直肠癌等各类由于饮食结构不合理导致的疾病也随之而来，代谢综合征的患病率在世界范围内急剧增加并达到流行水平[1]。抗性淀粉（Resistant starch，RS）作为一种来源广泛、口感良好的新兴食品原料，具有饱腹感强、消化率低、血糖生成指数低等特点，受到广泛关注[2−3]。RS的性质与溶解性纤维相似，可发挥出膳食纤维的功效，可降低由糖尿病和心血管等高脂饮食相关疾病的风险，对高血脂症、高血压和糖尿病患者具有非常积极的作用[4−6]。研究证实，RS 不仅可以降低总胆固醇、甘油三酯等的含量，对肠道微生物菌群及肠道上皮细胞更具有调节和保护作用[7−8]。短链脂肪酸是厌氧微生物在肠道内发酵分解抗消化多糖、蛋白质、多肽等物质生成的代谢产物[9]。Akbaryan 等[10]发现，RS 进入大肠后能够促进有益微生物代谢，使肠道中有益微生物发酵RS 与肠道代谢产物被吸收利用，从而有效降低2 型糖尿病、结直肠癌的风险，可预防和缓解一些由于不健康饮食所引起的慢性疾病[11]。白建江等[12]的研究结果表明，高抗性淀粉稻米可较明显地降低2 型糖尿病大鼠血糖的作用和糖耐量的提高，有明显改善2 型糖尿病大鼠脂代谢紊乱和降脂的作用。目前，国内外对RS的研究多为香蕉、鹰嘴豆、莲子等单一品种，对于复合性抗性淀粉研究较少，本文将绿豆、苦荞、藜麦混合后制成复合RS。

本文探究了复合RS 对高糖高脂小鼠体质量、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein，HDL-C）、肝糖原及肠道内容物短链脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs）等指标的影响，为多元复合RS 作为高血糖症、高血脂症人群的膳食主料提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级雄性C57BL/6 小鼠（SCXK（京）2019-0008） 60 只，4 周龄，体质量在18～22 g 之间，由吉林农业大学实验动物中心提供，喂养期间，动物室内设置12 h 光暗交替循环，小鼠可自由获取饮食和随意饮水，维持动物室内温度在21～25 ℃之间，湿度50%～70%，饲养于吉林农业大学实验动物中心SPF实验室[13]；高糖高脂饲料配方：基础饲料52.5%、猪油10%、胆固醇2%、蔗糖30%、蛋黄粉5%、胆酸盐0.5%[14]；二甲双胍 上海施贵宝药厂；氯化钠 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甘油 范德（北京）生物科技有限责任公司；正己酸、硫酸 北京化工厂；无水乙醚 天津市北联精细化学品开发有限公司；三诺安稳血糖试纸 三诺生物传感股份有限公司；总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒、高密度脂蛋白试剂盒、肝糖原试剂盒 上海酶联生物科技有限公司。

三诺安稳血糖仪 三诺生物传感股份有限公司；H01-B 电子天平 厦门雄发仪器仪表有限公司；GRM-1 磨粉机 天津市秦斯特仪器有限公司；TL80-2高速离心机 江苏天力医疗器械有限公司；GC-2010型气相色谱 日本岛津公司；MK-X 洁净动物培养箱 上海堃择实业有限公司；Systec V-75 立式压力蒸汽灭菌器 山东新华医疗器械股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多元复合RS 制备 绿豆、苦荞、藜麦，市售。磨粉处理，过筛100 目，绿豆粉、苦荞粉和藜麦粉以1:1:1 比例充分混匀[15]。压热方法制取抗性淀粉，121 ℃下压热反应30 min 冷却至室温后，加入0.2%α-淀粉酶，在70 ℃恒温水浴锅中水解1 h，冷却至室温。添加0.4%普鲁兰酶，恒温60 ℃下酶解12 h 后取出，100 ℃灭菌10 min，冷却至室温。在4 ℃冰箱中冷藏24 h，60 ℃烘干至恒重粉碎过100 目筛，制得多元复合RS，得率为27.3%。

1.2.2 高糖高脂模型小鼠的建立及分组 将60 只小鼠随机成6 组，每组10 只，分为正常对照组、模型对照组、RS 低剂量组、RS 中剂量组、RS 高剂量组和阳性对照组。在基础饲料喂养下使小鼠适应实验室环境1 周后，模型对照组、RS 低剂量组、RS 中剂量组、RS 高剂量组、阳性对照组小鼠进行自由饮食，进入8 周高糖高脂小鼠模型实验。8 周后，模型对照组、RS 低剂量组、RS 中剂量组、RS 高剂量组和阳性对照组小鼠经隔夜禁食处理后尾尖取血测空腹血糖，空腹血糖在12.0 mol/L 以上的小鼠可宣布高糖高脂小鼠模型成功[13]。各组小鼠连续灌胃4 周，各组灌胃试剂及剂量如表1。

表1 试验动物分组设计Table 1 Experimental design and animal grouping

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 小鼠处理 每周拾取新鲜的小鼠粪便，记录每只小鼠的体质量，尾处尖取血，使用血糖仪测定空腹血糖数值[17−18]。处死前12 h 小鼠禁食不禁水，解剖前进行称重、测血糖，摘取小鼠眼珠进行采血，然后将血样储存在4 ℃下干净的离心管中进行3000 r/min、10 min 离心处理，将小鼠腹腔和胸腔打开，将肝脏和结肠肠道内容物保存在甘油中，储存在−20 ℃冰箱中，用于测量肝糖原含量和SCFAs[19−21]。检测小鼠血清内TC、TG 和HDL-C 糖脂代谢指标，均严格按照试剂盒说明书进行操作[22]。

1.2.3.2 短链脂肪酸（SCFAs） 取0.2 g 肠道内容物，加入0.2 mL 正己酸。并向其中继续注入1.6 mL蒸馏水，摇匀，然后添加0.4 mL 50%硫酸和2 mL 无水乙醚。然后将这一些取得液体在振荡器上于120～160 r/min 混合30 min。混合后，加入无水氯化钙，然后以3000 r/min的速率离心5 min。最后，取上清液用于气相检测。SCFA的测定使用外标方法绘制乙酸、丙酸和丁酸的标准曲线。氢火焰探测器（FID）；色谱柱为DB-FFAP；载气为N2，分流比为10:1，流速为2 mL/min；炉温240 ℃，进样量为2 μL；初始温度在120 ℃下持续5 min，然后以10 ℃/min的温度升至250 ℃并保持1 min的加热程序[23]。

1.3 数据处理

运用SPSS（21）统计软件进行数据分析。所有数据均表示为平均值±标准差（），各组小鼠之间的比较采用单因素卡方检验，P<0.05 为差异性显著，P<0.01 为差异性极显著。

2 结果与分析

2.1 多元复合RS 对小鼠体质量的影响

多元复合RS 对小鼠体质量的影响结果见表2。如表2 所示，正常对照组小鼠体质量涨幅均在正常范围内变化，在4 周小鼠高糖高脂模饮食实验后，模型对照组小鼠与正常对照组体质量有极显著差异（P<0.01）。4 周多元复合RS 干预后，RS 低、RS中、RS 高剂量组体质量与模型对照组相比均有一定降低，RS 高剂量组与模型对照组小鼠的体质量相比体质量下降9.24%，RS 高剂量组小鼠的体质量与正常对照组无显著性差异（P>0.05）。结果表明，RS 能有效减缓高脂饮食诱导的小鼠体重的快速上升，且其效果与剂量存在依赖关系。

表2 多元复合RS 对小鼠体质量的影响(g)Table 2 Effect of multiple compound RS on the body weight of mice(g)

2.2 多元复合RS 对小鼠血清中血糖含量的影响

多元复合RS 对小鼠血清中血糖含量的影响结果见表3。如表3 所示，72 h 后检测血糖浓度，各干预组小鼠血糖值均高于12.0 mmol/L 以上，模型对照组与正常对照组相比差异极显著（P<0.01），高血糖小鼠造模成功。经4 周灌胃后，模型对照组血糖浓度呈持续增高趋势；RS 高剂量组与模型对照组相比小鼠血糖浓度极显著降低（P<0.01），下降了59.71%，且RS 高剂量组与阳性对照组血糖浓度无显著差异（P>0.05），说明多元复合RS 可有效控制血糖，RS 高剂量的多元复合RS 降血糖功能效果更佳。

表3 多元复合RS 对小鼠血清中血糖含量的影响(mmol/L)Table 3 Effect of multi compound RS on blood glucose of mice(mmol/L)

2.3 多元复合RS 对小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C含量的影响

多元复合RS 对小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C含量的影响结果见表4。如表4 所示，在为期4 周的实验过程中，模型对照组小鼠血清TC 和TG 与正常对照组相比有极显著的升高（P<0.01），HDL-C 极显著减少（P<0.01）。RS 高剂量组的TC、TG 与模型对照组相比均有极显著减少（P<0.01），分别下降31.22%、36.72%，RS 中剂量组、RS 高剂量组的效果与阳性对照组相似无显著差异（P>0.05）。由实验结果可知，多元复合RS 与阳性药物二甲双胍两者都能有效的减弱高糖高脂小鼠血清TC 和TG 水平。RS 高剂量组与模型对照组相比，RS处理能显著升高小鼠血清中HDL-C 水平（P<0.01），上升58.93%。实验表明，多元复合RS 可以有效控制小鼠血清中TC 和TG 含量，可提升小鼠血清中的HDL 水平。

表4 多元复合RS 对小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C 含量的影响Table 4 Effect of multi-component RS on the serum contents of TG,TC,and HDL-C in mouse

2.4 多元复合RS 对小鼠肝糖原含量的影响

多元复合RS 对小鼠肝糖原含量的影响结果见表5。

表5 多元复合RS 对小鼠肝糖原含量的影响Table 5 Effect of multiple compound RS on hepatic glycogen in mice

体内的肝糖原代谢调节血糖水平，饭后或糖分摄入后为了降低血糖水平，摄入过多的葡萄糖可进入肝脏以肝糖原的状态储存起来；当体内血糖不足时，肝糖原经磷酸化酶催化代谢产生葡萄糖，进入血液中维持血糖稳定，保证机体内环境稳态。如表5 所示，模型对照组与正常对照组相比肝糖原含量极显著降低（P<0.01），RS 处理组小鼠肝糖原相比于模型对照组均有升高，其中RS 高剂量组与模型对照组相比肝糖原含量极显著升高207.86%（P<0.01）。经4 周的多元复合RS 诱导后，RS 高剂量组的肝糖原含量与阳性对照组无显著差异（P>0.05）。说明多元复合RS 能有效提高小鼠体内肝糖原浓度，且其效果与剂量存在依赖关系。

2.5 多元复合RS 对小鼠结肠SCFAs的影响

2.5.1 多元复合RS 对结肠中乙酸的影响 多元复合RS 对结肠中乙酸的影响结果见图1。

图1 多元复合RS 对结肠中乙酸的影响Fig.1 The effect of multiple compound RS on acetic acid in colon

如图1 所示，在4 周干预中，多元复合RS 灌胃小鼠结肠中乙酸含量显著高于正常对照组、模型对照组、阳性对照组小鼠结肠中乙酸浓度，模型对照组与RS 低剂量组、RS 中剂量组、RS 高剂量组乙酸浓度增长较为明显。干预灌胃初期，各组增长变化较为缓慢，干预4 周时，RS 低剂量组、RS 中剂量组、RS 高剂量组结肠中乙酸的含量与模型对照组相比均有显著升高，RS 高剂量组的小鼠结肠中乙酸浓度高于其他各组，说明一定剂量的多元复合RS 可有效促进小鼠肠道厌氧菌群代谢产生乙酸。

2.5.2 多元复合RS 对结肠中丙酸的影响 多元复合RS 对小鼠结肠中丙酸含量的影响结果见图2。

图2 多元复合RS 对小鼠结肠中丙酸含量的影响Fig.2 Effect of multiple compound RS on propionic acid contents in colon of mice

如图2 所示，随着干预时间增加，多元复合RS 灌胃的小鼠结肠中丙酸浓度均有不同程度的上升,多元复合RS 灌胃的小鼠结肠中丙酸浓度明显超过了正常对照组、模型对照组、阳性对照组小鼠结肠中丙酸浓度。在2 周干预后RS 高剂量组与RS 中剂量组小鼠结肠中的丙酸浓度明显高于RS 低剂量组，在4 周时RS 高剂量组与RS 低剂量组、RS 中剂量组相比丙酸含量显著升高。说明一定剂量的多元复合RS 可有效促进小鼠肠道代谢产生丙酸。

2.5.3 多元复合RS 对结肠中丁酸的影响 多元复合RS 对结肠中丁酸的影响结果见图3。

图3 多元复合RS 对小鼠结肠中丁酸含量的影响Fig.3 Effect of multiple compound RS on butyric acid contents in colon of mice

如图3 所示，随着干预时间增加，多元复合RS 灌胃的小鼠结肠中丁酸浓度均有不同程度的上升,多元复合RS 灌胃的小鼠结肠中丙丁酸浓度明显超过了正常对照组、模型对照组、阳性对照组小鼠结肠中丁酸浓度。各组多元复合RS 小鼠在干预后，各组中丁酸浓度以较快的速度增长，在干预2 周后RS 高剂量组与RS 中剂量组小鼠结肠中丁酸浓度明显高于RS 低剂量组，在4 周时RS 低剂量组、RS 中剂量组、RS 高剂量组的丁酸浓度与模型对照组的丁酸浓度差异显著。一定剂量的多元复合RS 可有效促进小鼠肠道代谢产生丁酸。

3 讨论与结论

大量研究表明，RS 对体质量和血糖水平具有调节作用，因其具有抗消化的特点，RS 可明显降低空腹和餐后血糖，增加胰岛素敏感性，起到控制干预糖尿病病情的作用[24]。试验结果表明，连续灌胃4 周后多元复合RS 能有效控制由于高糖高脂饮食引起的小鼠的体重异常，一定剂量的多元复合RS 具有与阳性药物二甲双胍相当的降低高糖高脂模型小鼠餐后血糖的作用，可有效调节血糖值。有研究表明RS 具有调节血脂的作用[25]，多元复合RS 能降低小鼠血清中 TC、TG的含量，增加 HDL的含量，有效改善脂质代谢异常高糖高脂小鼠血脂水平，对脂代谢紊乱进行纠正，对高糖高脂小鼠具有一定的调节血脂作用。2 型糖尿病患者肝组织的肝葡萄糖输出量异常和胰岛素抵制作用，RS 可以在肝糖原修复中发挥作用，人体机体对于胰岛素含量的敏感程度通过肝脏组织糖原含量的变化可有效反映[26−27]。经多元复合RS 灌胃的小鼠肝糖原含量均有明显增加，推测多元复合RS 能有效促进肝糖原的合成或降低肝糖原的分解速率，有效地改善肝功能。RS 促进乙酸、丙酸、丁酸浓度升高可调节肠道内酸碱度降低，积极促进有益菌的生成，减少肠道腐败菌的数量，肠道菌群达到平衡的状态，并且对维持机体生命活动的能量输送和调控具有重要作用，产生的SCFAs 能在短期内降低肝葡萄糖的产量从而减少输出[28−29]。杨玥熹等[30]、贾彦等[31]的研究表明，RS 可促进乙酸、丙酸、丁酸的合成，提高结肠中SCFAs的含量。多元复合RS 由三种原料谷物混合提取而成，存在多种膳食纤维与微量元素，三种原料之间是否有协同促进作用及其作用机理有待进一步深入研究。

综上所述，以绿豆、苦荞、藜麦三种谷物为原料制得的多元复合RS，能有效地控制高糖高脂模型小鼠的体质量增长，有效调节小鼠血糖水平，促进肝糖原合成；多元复合RS 可调节小鼠血脂浓度，降低小鼠血清中 TC、TG的含量，增加 HDL的含量，有效改善脂质代谢紊乱，预防高血脂症；多元复合RS 可积极促进肠道内菌群发酵产生SCFAs，有助于肠道中SCFAs的代谢，促进小鼠肠道中发酵产生的乙酸、丙酸、丁酸含量，调节肠道菌群。对研究开发高糖高脂不良饮食习惯人群相关功能保健食品的适用性提供了参考依据。