长寿人群饮食中膳食纤维对C57BL/6小鼠的抗氧化效果

饶川艳，于晓涵，梅丽华，聂梦琳，李全阳, ，李 丽,3,

（1.广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所，广西南宁 530007；2.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530000；3.广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西南宁 530007）

膳食纤维被誉为第七大营养素，不仅是维持生物体多项生理功能必不可少的天然物质，还具有抗氧化、抗病毒、预防癌症以及免疫调节等功能[1−5]。随着时间的推移，机体脏器组织衰老，导致机体组织功能下降，极易引发疾病甚至死亡[6]。前人认为自由基和活性氧在机体内累积，是造成氧化应激而导致机体加速衰老的原因之一[7]。有研究发现机体神经退行性疾病和老年疾病通常伴随着机体氧化应激反应的发生而发生[8]。

广西巴马是世界著名的长寿之乡，本团队前期对广西巴马长寿人群饮食研究发现：广西巴马长寿人群饮食以高膳食纤维食物为主，其中膳食纤维的摄入量占除水外6 大营养素摄入量总和的8.22%[9−10]。本研究从广西巴马人群膳食中最具代表性果蔬入手开展研究，经过调查这些代表分别是：香蕉、脐橙、红薯叶、南瓜苗、苦荬菜、空心菜和茶树菇[10]。果蔬膳食纤维中的纤维素、半纤维素、木质素、抗性淀粉、果胶、多糖等能够对机体的血糖、血脂和免疫功能进行调节，同时还能够调节肠道菌群、促进肠道健康，以及增强机体康肿瘤的能力[11−15]。为此，本研究选取这些长寿老人膳食中最具代表性的香蕉、脐橙、红薯叶、南瓜苗、苦荬菜、空心菜、茶树菇膳食纤维，以C57BL/6 小鼠为研究对象，通过对小鼠生长特性和小鼠机体的抗氧化效果评估，探究长寿人群膳食中膳食纤维在延缓衰老中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

C57BL/6 小鼠 6 周龄，SPF 级，雄性广西医科大学（实验动物生产许可证号：SCXK（桂）2014-0002）；基础饲料 北京科奥协力饲料有限公司；MDA 试剂盒、总抗氧化活性（T-AOC）试剂盒、总超氧化歧化酶（T-SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒 南京建成生物研究所；脂褐素（Lip）试剂盒 索莱宝试剂公司；香蕉膳食纤维、脐橙膳食纤维、红薯叶膳食纤维、南瓜苗膳食纤维、苦荬菜膳食纤维、空心菜膳食纤维、茶树菇膳食纤维为实验室自制。

KC-701 超微粉碎仪 北京开创同和科技发展有限公司；YL100L2-4 型饲料造粒机 淄博银启机械制造有限公司；JRA-2 型数显磁力搅拌水浴锅 金坛市科杰仪器厂；3-18KS 型冷冻离心机 Sigma（中国）；TG16W 型微量高速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；WGUL-230BE 型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；BSA124S 天平 赛多利斯科学仪器（中国）有限公司；GENESYS 10S 型 UVVIS 分光光度计 Thermo（中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 膳食纤维的制备 称取过筛后的果蔬原料，按照一定固液比加入蒸馏水，混匀后于70 ℃热水浴提取3 h。提取结束后，冷却至室温，于10000 r/min 离心15 min，沉淀真空冷冻干燥得不溶性膳食纤维（IDF）；上清液65 ℃真空浓缩至原体积1/3，转至烧杯中，加入4 倍体积无水乙醇，4 ℃静置醇沉8 h，8000 r/min 离心10 min后收集沉淀冷冻干燥得可溶性膳食纤维（SDF）。

1.2.2 实验饲料的设计 依据前述研究结果，综合王芳[10]及蔡达[16]对广西巴马长寿老人饮食的调查结果，结合人与动物给药剂量的换算方法，设计膳食纤维饮食10 组，对照组1 组。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7 为7.5%单一膳食纤维添加组，分别是香蕉、脐橙、红薯叶、南瓜苗、苦荬菜、空心菜、茶树菇膳食纤维；R8 为7.5%复合膳食纤维组（其中香蕉:脐橙:红薯叶:南瓜苗:苦荬菜:空心菜:茶树菇=0.5:0.5:1:1:1:1:1）；R9 为15%复合膳食纤维组；R10 为30%复合膳食纤维组；C1 为全基础饲料对照组。

1.2.3 小鼠分组及采样 55 只C57BL/6 小鼠随机分为11 组，每组5 只，为别为C1、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9 和R10。饮食干预前，6 周龄小鼠基础饲料适应性喂养一周，适应期间各组小鼠不限饮食，自由饮水。适应期结束后收集小鼠粪便，继而开展饮食干预试验，试验期间小鼠自由饮食、饮水，连续喂饲4 周。饲喂结束后，所有小鼠禁水禁食12 h，称量体重，麻醉后摘取眼球取血，于冰上解剖，取心、肝、脾、肾，保存于−80 ℃；所采集血液于4 ℃环境中静置12 h 后以4000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，保留上清液并分装，保存于−80 ℃，待后续检测生化指标。

1.2.4 脏器系数的计算

其中，m1为脏器质量，g；m2为小鼠体重，g。

1.2.5 小鼠抗氧化指标的测定 将解剖取出的肝脏组织，称重，加入9 倍的磷酸缓冲液，在冰浴中使用匀浆器进行匀浆，制得10%肝脏组织匀浆液，于4 ℃、4000 r/min 条件下离心10 min。取肝脏组织上清液与血清，使用南京建成生物试剂盒测定其MDA、Lip 含量，T-SOD、GHS-Px 活力以及T-AOC 水平。

1.2.6 综合量化评价方法 参考李全阳等[17]的综合量化方法，对10 种配方饮食中3 项抗氧化指标、2 项氧化指标进行指标的正向化和归一化处理。正向化处理公式：

式中，yij为样品ij的正向化值；xij为ij 样品某项逆向指标的测定值。归一化处理公式：

式中，yij为样品i的归一化值；xij为样品某项指标测定值。

通过指标正向化和归一化处理，初步对10 种配方饮食的抗氧化衰老效果进行综合量化评价，以直观反映不同配方饮食对抗氧化应激的作用效果。

1.3 数据分析

实验数据采用 SPSS19.0 软件进行统计分析，实验数据以表示。两组间比较采用独立样本t检验进行分析，P<0.05 表示数据具有统计学意义，使用Origin 8.1 绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同膳食纤维对小鼠体重的影响

体重作为衡量机体健康状况的重要指标之一，体重增长的速率可以直观的反映机体生长发育情况[18]。由表1 可知，试验结束时，与对照组相比，除R5 外，其余各组小鼠体重总增长量均无显著性差异（P>0.05）。R5 组小鼠体重增长量显著低于对照C1组（P<0.01），说明苦荬菜膳食纤维能抑制小鼠体重的增长。R8、R9 和R10 处理组，随着混合膳食纤维剂量的增大，小鼠体重增长量减小，表明在一定剂量范围内，高剂量的混合膳食纤维能够抑制小鼠体重的增长。张玲[19]给6 周龄健康雄性小鼠分别饲喂含20%可溶性膳食纤维微晶纤维素（MCC）、28%不可溶性膳食纤维燕麦β-葡聚糖以及不含膳食纤维的饲粮21 d 后发现，3 组小鼠体重差异均不显著（P>0.05）；王赛男等[20]研究了大豆不溶性膳食纤维对高脂诱导小鼠肥胖的预防作用及其机理，研究发现大豆不溶性膳食纤维可以控制小鼠体重的增长。对照本研究结果，表明了在小鼠饮食中添加长寿人群饮食中的膳食纤维不会影响小鼠的正常发育，且R5 可以抑制小鼠体重的增长。

表1 膳食纤维饮食对各种小鼠体重的影响（n=5）Table 1 The effects of characterized dietary on body weight of mice in each group（n=5）

2.2 不同膳食纤维对小鼠脏器系数的影响

脏器系数是动物试验中常用的指标，衰老或受损的脏器重量会发生变化，因此脏器系数也随之而改变，脏器系数减小，表示脏器萎缩或其他退行性改变[21]。由表2 可知，与对照组C1 相比，除R7、R3 外，其余各组小鼠心脏系数均有所提高，其中R8、R9 小鼠心脏系数提高了7.22%（P<0.05）。和C1 对照组相比，各组膳食纤维饮食小鼠肝脏系数均有所下降，其中R5、R7、R8 小鼠肝脏系数分别下降了13.51%、21.43%和34.56%（P<0.01）；R2、R4、R9、R10 小鼠肝脏系数分别下降了8.88%、9.84%、9.65%、10.81%、5.98%（P<0.05）。除R5 组外，其余各组膳食纤维食组肾脏系数与对照组C1 肾脏系数相比，均无显著性差异（P>0.05）。与C1 对照组相比，膳食纤维饮食组除R7、R8 外，其余各组小鼠脾脏系数均有所提高，其中R4、R10 小鼠脾脏系数分别提高了10.00%、15.00%（P<0.05）。龙婷婷等[22]的研究发现，高剂量的白尾参多糖明显促进了小鼠脾脏和胸腺的增大。对照本研究结果，认为在小鼠饮食中添加巴马长寿人群饮食中的膳食纤维，可以延缓小鼠心脏、肾脏、脾脏的退化。

表2 膳食纤维饮食对各组小鼠脏器系数的影响（n=5）Table 2 Effects of characterized dietary on organ coefficients of mice（n=5）

2.3 不同膳食纤维对小鼠脂过氧化产物含量的影响

2.3.1 不同膳食纤维对小鼠MDA 含量的影响 膳食纤维饮食干预后各组小鼠血清和肝脏组织中MDA 含量的检测结果如表3 所示。

表3 小鼠血清和肝脏组织中MDA 含量（n=5）Table 3 The MAD content in serum and liver of mice（n=5）

MDA 作为脂质过氧化的生物标志物，可以用于评估脂质的氧化程度[23]。从表3 可知，经过饮食干预后，与C1 组相比，膳食纤维饮食各组小鼠血清中MDA 含量均有一定程度的降低，其中R1、R3、R4、R6 和R10 分别降低了48.21%、53.74%、41.44%、57.56%和59.14%（P<0.01），R7 和R8 分别降低了39.27%和38.07%（P<0.05），R2、R5 和R9 分别降低了4.82%、20.00%和35.20%；C1 组小鼠肝脏中MDA 含量为（38.33±0.24）nmol/mgprot，与C1 组相比，各组小鼠中，除R5 组小鼠肝脏中MDA 含量升高了21.71%（P<0.01）外，R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R10 各组小鼠肝脏中MDA的含量分别极显著降低了46.93%、62.01%、67.49%、33.81%、50.80%、68.88%、72.16%和77.59%（P<0.01），R3 组小鼠肝脏中MDA 含量显著降低了10.59%（P<0.05）。刘佳维等[24]研究发现，400 mg/kg的红参多糖使得小鼠血清和肝脏中的MDA 含量分别降低了12.8%和40.23%。对照本研究结果，认为在小鼠饮食中添加巴马长寿人群饮食中的膳食纤维，对小鼠体内的脂质过氧化过程具有一定的抑制作用。

2.3.2 不同膳食纤维对小鼠Lip 含量的影响 饮食干预后各组小鼠血清和肝脏组织中Lip 含量的检测结果如表4 所示。

Lip 又称老年素，沉积于肝脏、心机、神经等组织衰老细胞中，其随着细胞老化而增多，是衰老的重要指标之一[25]。肝脏是机体重要器官之一，在保护机体生理过程中发挥重要作用，与机体新陈代谢、排泄和储存等几个重要功能有关，且为内源性及外源性代谢物提供基本的解毒功能[21]。从表4 可知，经过饮食干预后，与C1 对照组相比，膳食纤维饮食各组小鼠血清中Lip 含量均显著降低，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10 血清中Lip 含量分别极显著降低了19.63%、26.70%、24.31%、27.98%、21.22%、26.88%、32.41%、34.93%、22.77%、34.08%（P<0.01）；C1 对照组肝脏中Lip 含量要高于其他膳食纤维饮食组，与R5、R7、R8 三组之间无显著性差异（P>0.05）；与C1 对照组相比，R1、R4、R6、R9、R10 肝脏中Lip 含量分别极显著降低了30.96%、31.84%、24.32%、24.32%、25.65%（P<0.01），R2、R3 肝脏中Lip 含量分别显著降低了15.04%、16.36%（P<0.05）。李海飞等[26]发现，与衰老对照组相比，低剂量的MS 活性糖可将致衰小鼠肝脏组织中Lip 含量降低了6.80%；Pan 等[27]的研究表明，洛巴伊口蘑多糖使得D-半乳糖至衰老小鼠肝脏组织中Lip的含量降低了22.91%。综上所述，本研究中的R1、R4、R6、R9、R10 这5 种膳食纤维饮食清除小鼠机机体Lip的效果更好些。

表4 小鼠血清和肝脏组织中Lip 含量（n=5）Table 4 Lip contents in serum and liver of mice（n=5）

2.4 不同膳食纤维对小鼠抗氧化酶活力的影响

2.4.1 不同膳食纤维对小鼠SOD 活力的影响 饮食干预后各组小鼠血清和肝脏组织中SOD 活力的检测结果如图1 所示。

图1 小鼠血清（a）和肝脏组织（b）中SOD 活力（n=5）Fig.1 The SOD activity in serum (a) and liver (b) of mice (n=5)

SOD 在清除自由基方面能发挥重要的作用，与对照相比，在许多病理模型中，SOD的活力显著低于对照[28]。由图1 可知，饮食干预后，与C1 相比较，膳食纤维饮食各组小鼠血清中SOD 活力均有提高的趋势，其中R1、R5 和R7 分别极显著提高了24.22%、21.45%、19.71%（P<0.01），R4、R9、R10 分别显著提高了17.24%、19.56%、16.22%（P<0.05），R2、R3、R6、R8 与C1 无显著性差异（P>0.05），分别提高了4.29%、12.00%、4.00%、11.71%；与C1 组相比较，R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10 肝脏中T-SOD 活力分别极显著提高了161.43%、159.39%、193.97%、175.17%、135.86%、125.41%、68.65%、103.39%、107.10%（P<0.01），R6 肝脏中T-SOD 活力提高了12.90%（P>0.05）。对于肝脏而言，抗氧化酶SOD 可以通过清除或者抑制自由基的产生，使肝脏细胞免于自由基的伤害[29]。Yang 等[30]的研究发现，诺丽果多糖显著增加了高脂饮食小鼠肝脏TSOD的活力（P<0.05），并且100 mg/kg 诺丽果多糖灌胃使得高脂小鼠肝脏中Nrf2的水平较对照组提高了35%，有效减轻了高脂小鼠的氧化应激反应；Wang 等[31]的研究发现，400 mg/kg 和800 mg/kg 山竹多糖的摄入，分别将糖尿病大鼠肝脏组织中TSOD 活力显著提高了52.32%和79.34%，有效缓解了糖尿病大鼠的氧化应激反应。与上述研究比较而言，本研究中R1、R2、R3、R4、R5、R7、R9、R10 这8 种配方饮食在提高肝脏组织中SOD 活力的效果更好些。

2.4.2 不同膳食纤维对小鼠GHS-Px 活力的影响饮食干预后各组小鼠血清和肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GHS-Px）活力的检测结果如图2 所示。

GHS-Px 是机体广泛存在的过氧化物分解酶，可以保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰和损害，其活力降低是细胞组织坏死的标志之一[32]。由图2 可知，膳食纤维饮食干预后，膳食纤维饮食各组小鼠除R10 组外，其余各组小鼠血清中GSH-Px 活性均有一定程度的提高，尤其是R1、R2、R3 三组小鼠血清中GSH-Px 活性分别极显著提高了117.64%、136.08%和35.79%（P<0.01），R4、R5、R6、R7、R8、R9 血清中GSH-Px 活力分别提高了16.42%、17.12%、21.73%、8.82%、6.05%、1.90%，而R10 组小鼠血清中GSH-Px 活力极显著降低了45.13%（P<0.01）；膳食纤维饮食各组小鼠肝脏中GSH-Px 活力显高于C1 对照组，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10 肝脏中GSH-Px 活力分别提高了43.42%、67.18%、140.47%、60.11%、56.55%、42.09%、53.89%、50.00%、48.66%、26.40%（P<0.01）。Wang 等[33]的研究发现肥胖小鼠以400 mg/kg的剂量给予竹荪多糖后，与模型肥胖组相比，给药肥胖小鼠肝脏中GHS-Px 活力达到（89.81±4.31）U/mgprot，其活性高于模型肥胖组；Wahid 等[34]发现，四氯化碳中毒的大鼠在以100 mg/kg的剂量给车前草膳食纤维后，其肝脏组织中GHS-Px 活力可以恢复；Zhao[35]发现糖尿病大鼠肝脏中GHS-Px 水平低于健康大鼠，但是口服中等剂量魔芋膳食纤维后，其GHS-Px 水平较模型糖尿病对照小鼠提高了40.37%。本研究中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9 这9 种膳食纤维饮食在提高肝脏GHS-Px 活力水平方面具有良好的促进作用。

图2 小鼠血清（a）和肝脏组织（b）中GHS-Px 活力（n=5）Fig.2 The GHS-Px activity in serum (a) and liver (b) of mice (n=5)

2.5 不同膳食纤维对小鼠T-AOC 水平的影响

饮食干预后各组小鼠血清和肝脏组织中总抗氧化能力（T-AOC）水平的检测结果如图3 所示。

图3 小鼠血清（a）和肝脏组织（b）中T-AOC 水平（n=5）Fig.3 The T-AOC level in serum (a) and liver (b) of mice (n=5)

T-AOC 水平的高低可以反应机体非酶系统对自由基的代谢状态以及机体内各抗氧化剂之间的协同作用。由图3 可知，膳食纤维饮食干预后与C1 组相比较，除R3、R4、R10 外，其他各组小鼠血清的总抗氧化能力均有一定程度的提高。其中R5 血清中TAOC 极显著提高了146.53%（P<0.01），R1、R6、R7 显著分别提高了66.86%、101.80%、100.16%（P<0.05），R2、R8、R9 血清中T-AOC 分别提高了40.08%、24.73%、8.73%，然而R3、R4、R10 分别降低了7.92%、20.65%、8.57%；膳食纤维饮食各组小鼠肝脏中T-AOC 除R2 外，其余各组T-AOC 均高于C1-对照组。其中R1、R3、R6、R7、R8、R9、R10 肝脏中T-AOC 分别极显著提高了，152.23%、203.69%、403.21%、611.72%、292.83%、334.94%、916.65%（P<0.01），R4 肝脏中T-AOC 水平提高了66.62%（P<0.05），R5 肝脏中T-AOC 水平提高了21.25%，然而R2 肝脏中T-AOC 水平降低了0.06%，R5 与C1 肝脏中T-AOC 水平无显著性差异（P>0.05）。林为艺等[36]比较了铁皮石斛多糖及非多糖成分对高糖、高脂、饮酒致代谢性高血压大鼠模型体内抗氧化水平进行了比较，发现铁皮石斛粗多糖将模型大鼠的T-AOC 水平显著提高了63.49%；Niu 等[37]研究了海棠花多糖的免疫调节作用，研究发现，海棠花多糖可以增加免疫抑制模型小鼠血清和脾脏中T-AOC 水平，其中中剂量组将模型小鼠脾脏中T-AOC 水平提高了31.02%。本研究中R1、R3、R6、R5、R7、R8、R9、R10 这8 种膳食纤维配方饮食在提升C57BL/6 小鼠血清或肝脏T-AOC 水平具有一定的促进作用。

2.6 综合量化评价

MAD 和Lip 是逆向指标，是机体脂过氧化产物和衰老指标，其值越大，表示机体氧化反应越强烈；SOD 和GHS-Px 为正向指标，是机体重要的抗氧化酶，参与机体的抗氧反应；T-AOC 是正向指标，表示机体的总抗氧化能力，其值越大，机体抗氧化能力越强。对10 种膳食纤维配方饮食初步进行综合量化评价，以便更加直观反映不同膳食纤维饮食在抗氧化上的作用效果，结果见表5。

由表5 可知，通过综合量化评价，得到10 种膳食纤维饮食在抗氧化应激作用上的优劣顺序为：R7>R10>R9>R8=R3>R6>R5>R1>R4>R2。其中，7种单一膳食纤维添加在抗氧化应激作用上的顺序为：R7>R3>R6>R5>R1>R4>R2；3 种不同剂量混合膳食纤维添加在抗氧化应激作用上的顺序为：R10>R9>R8。总体来说除R7 外，复合膳食纤维抗氧化效果优于单一膳食纤维，且在30%添加量内，复合膳食添加量越高，其抗氧化衰老效果越好。宋奇等[8]的研究发现，高膳食纤维摄入有助于缓解衰老机体的氧化应激水平；章海风等[38]的研究发现，多种混合膳食纤维较单一膳食纤维相比，其抗氧化应激反应更强。李全阳等[17]利用综合量化评价初步建立起一套乳酸质量评价方法；宋奇等[8]利用综合量化评价对5 种饮食模式进行综合评价，得到5 种饮食模式的抗衰老效果排序。可见，综合量化评价适用于不同对象的不同指标进行综合评定。

表5 10 种膳食纤维配方饮食综合量化评价结果Table 5 The comprehensive evaluations results of 10 dietary fiber formula diets

本研究则采用综合量化评价，对其中的2 项衰老指标和3 项抗氧化指标采用综合量化评价的方式进行综合评价，通过严谨推算得到了10 种膳食纤维配方饮食对C57BL/6 小鼠抗氧化效果的优劣排序。其中茶树菇膳食纤维、15%复合膳食纤维组、30%复合膳食纤维组的R7、R10、R9 获得综合评分的前三名。从这个排序也得到两个启示，第一，茶树菇膳食纤维抗氧化效果表现突出；第二，食物中添加复合型的膳食纤维抗氧化效果会更好些，在30%添加量范围内，添加总量越多抗氧化效果越好。

3 结论

本研究从广西巴马长寿人群饮食中分离所得的7 种代表性果蔬膳食纤维入手，设计了10 种膳食纤维饮食方式，并利用C57BL/6 小鼠比较了10 种膳食纤维饮食方式对机体氧化应激的改善作用。发现10 种膳食纤维饮食方式对C57BL/6 小鼠都具有一定的抗氧化作用，都能够抑制机体内脂质过氧化产物Lip 和MDA的累积，提高抗氧化酶SOD，GHSPx 活力以及T-AOC 水平；综合量化评价比较发现，茶树菇膳食纤维抗氧化能力特别突出，食物中添加复合型的膳食纤维较添加单一膳食纤维效果更好，还发现在30%添加范围内，膳食纤维添加总量越多，其抗氧化效果越好。本研究发现的这些特性，这不仅验证巴马长寿人群膳食中膳食纤维的抗氧化衰老作用效果，给巴马长寿核心区饮食的益生效果提供了理论支持，也为有关个性化健康饮食的开发提供了一些新线索。