鸡桑、华桑和桑的根皮中7 种核苷类成分的含量测定

黎海灵，黄艳萍,，周 游，陈旭冰, ，徐 金，周 浓,,

（1.大理大学药学院，云南大理 671000；2.重庆三峡学院生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120）

桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥根皮称为桑白皮，其药用历史悠久，始载于《神农本草经》，是泻白散、华盖散、桑白皮汤等古代经典名方的重要组成药味[1]。2020 版《中国药典》一部记载桑白皮味甘、寒，归肺经，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少，面目肌肤浮肿等功效[2−3]。桑科植物鸡桑（Morus australisPoir.）或华桑（Morus cathayanaHemsl.）的干燥根皮称为崖桑皮，其入药与桑白皮具有相似的功效，作为川渝民用药材被2010 版《四川省中药材标准》收载[4]。桑白皮因具有降血脂[5−7]、镇痛抗炎[8−9]、抗癌保肝[10]、免疫调节[11]等药理作用，于2002 年被列入卫生部发布的保健食品类中药名单中[12]。同时，桑白皮还常被用于制作具有一定保健功能的药膳食用，例如麻黄连翘桑白皮汤、桑白皮粥、南杏桑白皮猪肺汤等[13−14]。因此，桑白皮在疾病康复和日常食补中发挥着重要作用。

鸡桑、华桑和桑皮中研究较多的为黄酮类[15−16]、茋类[17]、生物碱类[18−19]、植物甾醇类[20−21]、香豆素类和多糖类[22−23]等活性成分，但对其含有的核苷类成分鲜有报道。核苷是一类由含氮碱基与糖缩合而成的糖苷，是构成生命体DNA 和RNA的基本物质，具有抗肿瘤[24−25]、抗菌[26−28]、抗血小板聚集[29−30]、免疫调节[31−33]等多种功效，这与桑皮的生物活性具有一定的关联性，可为其药材质量评价提供参考。目前关于不同产地鸡桑、华桑和桑的核苷类成分比较研究未见报道，本研究采用HPLC 法测定鸡桑、华桑和桑的根皮中7 种核苷类成分的含量，并采用聚类分析和主成分分析法对其进行评价，比较鸡桑、华桑和桑化学成分的差异，探究三种桑的质量等同性，以期为鸡桑、华桑代替桑使用，解决桑白皮基源单一的状况提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑、鸡桑、华桑 2018 年10 月采集于重庆市相关区县，对照药材购自相关中药材市场及公司，共58 批（表1），经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为桑科植物鸡桑（Morus australisPoir.）、华桑（Morus cathayanaHemsl.）和桑（Morus albaL.）的根皮；腺嘌呤、腺苷（批号分别为：110886-200001、110879-200202，纯度均≥98%） 中国食品药品检定研究院提供；胞苷、次黄嘌呤、鸟苷、尿嘧啶、2'-脱氧腺苷（批号分别为：PHA0053、PHA0024、PHA0064、PHA0060、PHA0071，纯度均≥98%） 南京都莱生物技术有限公司；甲醇 色谱纯，德国默克公司；水娃哈哈纯净水。

表1 不同产地的样品信息Table 1 The information of samples from different origins

LC-20AT 型高效液相色谱仪 日本岛津集团；SB-5200DTN 型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；TDZ5-WS 型多管架自动平衡离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；ML204 型分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；DZF-6050MBE 型电热恒温真空干燥箱 上海博讯实业有限公司；CP225D 型分析天平 德国Sartorius 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 选择自秋末叶落时至次春发芽前采挖的根部，刮去黄棕色粗皮，纵向剖开，剥取得到根皮[2,4]。因同一采收期不同植株的含量有所差异，实验采用不同居群单株采样以减少实验误差。将精选树龄相近的桑、鸡桑、华桑的根皮洗净后置于45 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎过三号筛，密封储存于4 ℃，用于品质分析。

1.2.2 对照品溶液制备 精密称取对照品胞苷、次黄嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脱氧腺苷，加水溶解，配制成浓度分别为0.007、0.061、0.018、0.033、0.042、0.006、0.017 mg/mL的对照品混合溶液。用0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

1.2.3 供试品溶液制备 精密称取药材粉末0.500 g，置具塞锥形瓶中，精密加水10 mL，混匀，在室温条件下超声（300 W，40 kHz）提取30 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量后，以4000 r/min 离心10 min，吸取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤即得[34]。

1.2.4 色谱条件 Venusil MP C18（5 μm，250 mm ×4.6 mm）色谱柱；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱程序如下表2 所示。检测波长为260 nm；流速：1.0 mL/min；进样体积：20 μL；柱温：30 ℃。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution conditions of mobile phase

1.3 方法学考察

1.3.1 线性关系考察 取1.2.2 对照品溶液制备液，按一定梯度稀释后在1.2.4 项色谱条件下进行测定，以各对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 精密度考察 取混合对照品溶液，按1.2.4 项下色谱条件连续进样6 次，记录各成分峰面积。

1.3.3 重复性考察 取样品粉末0.500 g，平行6 份，按1.2.3 项下的提取方法制备供试品溶液，按

1.2.4 项下色谱条件进行测定，记录各成分峰面积。

1.3.4 稳定性考察 取同一供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24 h 按1.2.4 项下色谱条件进行测定，记录各成分峰面积。

1.3.5 加样回收率考察 取6 份0.250 g 样品粉末，加混合对照品适量，按1.2.3 项下的提取方法制备供试品溶液，按1.2.4 项下色谱条件进行测定，记录各成分峰面积。

1.4 数据处理

采用Excel 2010 软件进行数据整理，运用SPSS 22.0 软件进行显著性分析、主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 样品的液相色谱测定结果

按照上述色谱条件对7 种核苷成分进行分析，对照品、样品色谱图见图1。结果表明各成分分离度较好，符合分析要求。

图1 对照品（A）、华桑（B）、鸡桑（C）和桑（D）的HPLC 图Fig.1 HPLC spectrums of references (A)，Morus cathayana(B),Morus australis (C) and Morus alba (D)

2.2 方法学考察结果

2.2.1 线性关系考察 测得7 种核苷的线性方程及其线性范围，如表3 所示。结果表明，7 种核苷的浓度与峰面积成线性关系，且线性关系良好。

表3 7 种核苷的标准曲线和线性范围Table 3 Standard curves and linear ranges of 7 nucleosides

2.2.2 方法学其他项考察结果 由表4 可知，胞苷、次黄嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脱氧腺苷的精密度、重复性、稳定性、加样回收率的RSD 均小于3%，且加样回收率在97.49%～101.45%之间，表明制备与检测方法的准确性良好，符合要求。

表4 精密度、重复性、稳定性、加样回收率考察结果（RSD%）Table 4 Precision,repeatability,stability and recovery (RSD%)

2.3 样品中7 种核苷的含量

按1.2.3 项下方法制备鸡桑、华桑和桑样品共58 批的供试品溶液，平行3 份。在1.2.4 项色谱条件下进行测定，计算鸡桑、华桑和桑皮根皮中7 种核苷类成分的含量，结果见表5。由表可知，所有样品均检测到了7 种单体核苷成分。鸡桑与华桑中胞苷含量范围在0.016～0.270 mg/g，次黄嘌呤含量范围在0.009～0.945 mg/g，鸟苷含量范围在0.039～0.325 mg/g，腺嘌呤含量范围在0.015～0.377 mg/g，尿嘧啶含量范围在0.059～0.429 mg/g，腺苷含量范围在0.016～0.311 mg/g，2'-脱氧腺苷含量范围在0.003～0.327 mg/g。桑白皮中胞苷含量范围在0.030～0.196 mg/g，次黄嘌呤含量范围在0.032～0.324 mg/g，鸟苷含量范围在0.067～0.353 mg/g，腺嘌呤含量范围在0.073～0.370 mg/g，尿嘧啶含量范围在0.066～0.322 mg/g，腺苷含量范围在0.046～0.262 mg/g，2'-脱氧腺苷含量范围在0.025～0.162 mg/g。鸡桑与华桑的胞苷、次黄嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脱氧腺苷的含量略低桑。从整体上看，鸡桑与华桑中核苷成分略低于桑；相同采集地点不同居群鸡桑、华桑和桑的根皮中核苷类含量具有差异，可能是由于生长地域、自然条件、栽培管理等不同引起次生代谢成分组成和含量的变化[35]。

表5 样品中7 种核苷类的含量（，n=3，mg/g）Table 5 Contents of 7 nucleosides in the sample（,n=3,mg/g）

表5 样品中7 种核苷类的含量（，n=3，mg/g）Table 5 Contents of 7 nucleosides in the sample（,n=3,mg/g）

续表 5

2.4 两独立样本t 检验

两独立样本t 检验是对两个样本均值检验，比较两样本中各成分含量的差异性。以鸡桑和华桑样本为一类，以桑样本为另一类，采用SPSS 22.0 统计软件对两类样本的7 种核苷类含量的数据进行独立样本t检验分析，如表6 所示。7 种单体核苷均具有方差相等（P1>0.05），（P2>0.05），表明以鸡桑和华桑制成的崖桑皮在核苷类成分层面与以桑制成的桑白皮无显著性差异，崖桑皮可代替桑白皮药用以缓解桑皮供应不足的问题。

表6 独立样品t 检验Table 6 The results of t-test

2.5 主成分分析

主成分分析是利用降维的思想，在损失很少信息的前提下把多个指标转化为几个综合指标的多元统计方法[36]。利用SPSS.22.0 对58 批样品中7 种核苷成分进行KMO 和Bartelett 球形度检验，结果显示KMO 统计量=0.640，Bartelett 球形度检验卡方统计量=141.452，自由度=21，P<0.001，表明数据适合做主成分分析。通过对58 批样品的单体核苷含量进行主成分分析，并提取了2 个主成分（特征值>1）进行分析，如表7 所示。主成分1的特征值为2.758，特征贡献率为39.401%；主成分2的特征值为1.673，特征贡献率为23.902%，2 个主成分的累积贡献率为63.303%。由表7 可知，主成分1 主要反映了鸟苷、尿嘧啶成分的主要信息；主成分2 主要反映了2'-脱氧腺苷成分的主要信息。对提取的主成分进行主成分得分计算（得分系数Z标准化数据）以及排序。计算公式：

表7 样品主成分阵距Table 7 Principal component matrix of samples

如表8 所示，对主成分1 来说，样品Y4的得分最高；对主成分2 来说，样品Y4的得分最高；综合得分最高的是样品Y4，说明样品Y4的鸟苷、尿嘧啶和2'-脱氧腺苷的含量较多，起到了主导的作用。根据2 个主成分的得分，并绘制散点图，见图2。如图，可将58 批样品分成4 组。其中，样品Y4 为第1 组；样品Y1、Y26、Y28、Y38 为第2 组；样品S5、S6、S10、Y19、Y20、Y21 为第3 组，其余的47 组样品均聚在一起，可看成一大组，即为第4 组。说明主成分分析未能将崖桑皮与桑白皮区分开来。

图2 样品主成分散点图Fig.2 Principal component scatter charts of samples

表8 样品主成分得分、综合得分及其排序Table 8 Scores of principal components,comprehensive scores and ranking for samples

2.6 聚类分析

聚类分析是一种可将一组数据按照本身内在的规律较合理地分为几类的探索性的分类方法[33]。利用SPSS 22.0 对58 批样品采用Euclidean 法进行聚类分析，结果如图3 所示。当欧氏距离为10.0 时，58 批样品可被分为4 大类：第Ⅰ类：Y4；第Ⅱ类：Y34、Y36；第Ⅲ类：S10、Y38；第Ⅳ类：剩余的样品。

图3 样品的聚类分析Fig.3 Results of cluster analysis of all samples

其中，第Ⅰ类与上述主成分分析中的第1 组相对应；第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类与2、3、4 组相对应。虽然有些类别和组别相互交叉，但聚类分析结果与主成分分析结果基本一致。综上所述，核苷含量相近或相同的崖桑皮与桑白皮在主成分和聚类分析中多距离较近，鸡桑、华桑和桑以核苷类成分为指标的层面存在交叉，表明各产地的鸡桑、华桑的核苷类成分含量与桑无明显差别。

3 结论

本文对鸡桑、华桑和桑的根皮中7 种核苷的含量进行测定，结果表明，58 批样品中均含有胞苷、次黄嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脱氧腺苷这7 种核苷，说明鸡桑、华桑和桑的根皮中的核苷类成分较为相似。对58 批样品进行主成分分析和聚类分析，结果表明不同基源桑属根皮的核苷含量有所不同，桑中7 种核苷的含量略高于鸡桑和华桑。与桑白皮标准药材相比，桑中的7 种成分含量显著高于标准药材桑白皮中7 种单体核苷的含量(P<0.05)，说明采集的桑样品符合药用指标。鸡桑、华桑根皮中的7 种单体核苷含量基本高于标准药材崖桑皮中7 种核苷的含量。鸡桑、华桑和桑的根皮中7 种单体核苷含量虽略有不同，但是区别不明显，它们属于同属不同种植物，基源相近，根皮的化学成分较为相似。

整体上来说，桑的根皮较其他鸡桑和华桑的根皮品质较好。但它们之间具有相同的活性成分，以华桑与鸡桑来源的崖桑皮药材中7 种单体核苷的含量和组成均无明显差异(P>0.05)，其核苷类成分具有一定的等同性，建议临床应用中应扩大对鸡桑和华桑的使用，以期崖桑皮代替桑白皮使用，解决桑白皮基源单一的状况。