基于适配体识别的金黄色葡萄球菌定性检测试纸条的研制及应用

张云红，彭云娉，卢春霞,2, ，黄 巧，严慧娟，魏 雪，任江涛

（1.长江师范学院现代农业与生物技术学院，重庆 408100；2.苏州赛飞福德检测科技有限公司，江苏苏州 215100；3.重庆市涪陵食品药品检验所，重庆 408100）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）隶属于葡萄球菌属，为革兰氏阳性菌，广泛存在于自然环境中，在适当的条件下（20～37 ℃）可产生肠毒素（Staphylococcal enterotoxins,SEs），引起食物中毒[1]。据统计，在我国和美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒数量占病原菌引起的食源性疾病的前五位[2−3]，对公共健康和食品安全带来巨大威胁。我国食品中金黄色葡萄球菌总体污染现状不容乐观，常污染肉和肉制品、乳和乳制品、禽蛋类制品、熟食制品等[4]，目前，我国食品安全国家标准（GB 29921-2013规定食品中金黄色葡萄球菌的可接受水平限量值为100 CFU/g（mL）、最高安全限量为1000 CFU/g（mL）[5]。因此，发展简便经济的的金黄色葡萄球菌快速检测方法是保障食品质量安全的重要技术手段。

目前，金黄色葡萄球菌的鉴定和检测方法主要有以下三种：（1）传统的微生物培养法：该法为金黄色葡萄球菌鉴定和检测的“金标准”[6]，但操作步骤复杂，耗时较长（3～5 d），无法满足快速检测及批量样品初筛的需要。（2）分子生物学检测技术：主要包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、环介导等温扩增反应等[7−8]，PCR 方法灵敏度高，但需要昂贵的精密仪器和专业的技术人员，无法在基层推广应用。（3）免疫学分析技术：该技术是目前检测金黄色葡萄球菌及肠毒素最为常用的快速检测技术，具有检测快速、操作简便等优势[9−10]。但其识别分子为抗体，抗体的制备需要免疫动物，存在周期长、成本高、抗体易受环境影响等不足。基于此，核酸适配体作为一种新型识别分子进入研究者的视野，并逐渐成为研究热点。

核酸适配体（Aptamer）是采用指数富集配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）从随机单链寡核苷酸库中筛选获得的可与靶标高特异性结合的一段单链核苷酸。其空间结构的多样性可与多种靶标如细胞因子[11]、蛋白[12]、金属离子[13]、小分子物质[14]、细胞[15]、微生物[16]等相结合。与传统的抗体相比，核酸适配体具有制备简单、成本低、性质稳定、应用范围广、易于标记和保存等优点。因此，适配体作为一种新型识别分子在分析领域成为人们研究的焦点[17]。近些年，研究者们利用SELEX 技术已筛选多条金黄色葡萄球菌适配体[18−19]，并利用筛选出的适配体建立了多种快速检测方法[20−21]。如Duan 等[20]将适配体固定在磁珠表面作为捕获探针，以适配体功能化的双色上转换纳米材料为检测探针，构建了一种可同时检测金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的新方法，该方法对两种食源性致病菌具有宽的线性范围（101～105CFU/mL）和低的检测限（8、5 CFU/mL）。Abbaspour 等[21]充分结合电化学传感器和核酸适配体的优点，设计了一种基于双适配体夹心的电化学传感检测方法，实现对金黄色葡萄球菌的定性及定量检测。

在诸多的快速检测技术中，试纸条层析技术具有操作简单、快速、低成本、肉眼可见结果等优点，被广泛应用于批量样品初筛和现场检测[22−23]。但目前很少见到基于适配体识别的金黄色葡萄球菌试纸条的研究报道。为此，本研究将胶体金层析技术的简便、快速和适配体的高亲和力、低成本等优势充分结合，构建一种简便、经济、快速的金黄色葡萄球菌适配体试纸条。与传统的胶体金试纸条相比，具有识别分子易制备、成本低廉等优点，为食源性致病菌的快速检测提供了新技术。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19155、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）O157:H7 ATCC25922、阪崎肠杆菌（Bntorobater sakazakii）ATCC29544、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae） 重庆市涪陵食品药品检验所提供；氯金酸（纯度>99%） Sigma-Aldrich公司；吐温-20、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris（2-chloroethyl）phosphate,TCEP）、三磷酸脱氧腺苷（dATP）、链霉亲和素、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、曲拉通X-100（Triton-100）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）、蔗糖、琼脂糖 生物工程（上海）股份有限公司；实验用水为超纯水（≥18.2 MΩ·cm）；玻璃纤维膜（8906）、硝酸纤维素膜（CN140）、吸水纸（H-1）、PVC 底板（J-B6） 上海捷宁生物科技有限公司；畜禽肉、乳制品和凉拌菜食品 本地超市；金黄色葡萄菌核酸适配体[18]由生物工程（上海）股份有限公司合成。

FEI Tecnai G2 F20 场发射透射电子显微镜 美国FEI 公司；HM3030/HM3035 XYZ 三维划膜喷金仪、ZQ4200 数控感应斩切机 上海金标生物科技有限公司；UV-2800 紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；5424R 台式冷冻离心机 德国艾本德公司；MS3 basic 涡旋混合器 德国IKA 公司；Gel Doc XR System 凝胶成像系统、Powerpac 300电泳仪 美国BIO-RAD 公司；BSD-100 振荡培养箱 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 适配体和探针序列及修饰 巯基修饰的适配体1（SH-apt 1）：5’-SH-C6-TCCCTACGGCGCTAACC CCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCA CCGTGCTACAAC-3’；生物素修饰的适配体2（Bioapt 2）：5’-Bio-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAAC CGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTA CAAC-3’；适配体1 互补DNA：5’-Bio-GTTGTAGCA CGGTGGCGGTGTGAGGCTGGGAGGACGGACTG GGGGGGTTAGCGCCGTAGGGA -3’。

1.2.2 纳米金的制备与表征 根据柠檬酸钠还原法[24]制备纳米金颗粒（Goldnanoparticles,GNPs），将100 mL 0.01%氯金酸溶液加热至沸腾，持续2 min，迅速加入2 mL 1%的柠檬酸三钠水溶液，直到溶液变成透亮的酒红色，继续加热10 min，停止加热，冷却至室温，4 ℃保存备用。

将纳米金溶液在400～800 nm 范围内进行扫描，获取金溶液的紫外-可见光光谱，测定纳米金的最大吸收波长[25]。纳米金颗粒的尺寸和形貌采用透射电镜表征，将制备的金溶液超声分散均匀后，滴在渡有碳膜的通网上，50 ℃干燥12 h，置于透射电镜样品台，在100 kV 电压下观察金颗粒的形貌和粒径[25]。

1.2.3 纳米金-适配体1（GNPs-apt 1）偶联物的制备与表征 参考文献方法[26]将巯基修饰的适配体1 通过Au-SH 共价方式结合到纳米金表面。首先取1 mL 纳米金溶液，用0.1 mmol/L K2CO3调pH 至7.4，10000 r/min、4 ℃离心10 min，弃去900 μL 上清，获得浓缩的纳米金溶液。加入适配体1 溶液，使其最终浓度为1 μmol/L，加入2 μL TCEP 溶液（1 mmol/L）中，常温避光活化1 h，加入上述纳米金溶液中，常温下偶联反应2 h。然后加入9 μL dATP 溶液（100 μmol/L），室温反应1 h。封闭结束后，加入NaCl 溶液，使其终浓度达到80 mmol/L，老化30 min，置于4 ℃继续老化过夜。将偶联物于10000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，弃上清，用100 μL 重悬液复溶（20 mmol/L Tris-HCl（pH8.5），5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl，1% BSA），4 ℃保存备用。将上述制备的纳米金-适配体1 偶联物及适配体1 用4%的琼脂糖凝胶电泳表征，电压120 V，电泳时间40 min。

1.2.4 试纸条的制备 玻璃纤维膜的处理：将玻璃纤维膜裁成2.0 cm 和0.5 cm 宽的条状，在处理液（0.1 mol/L Tris-HCl 溶液，1% NaCl，0.5% Tween-20，1% BSA，2%蔗糖，1% Triton X-100）中浸泡2 h，37 ℃烘箱中烘干，分别作为样品垫和结合垫，用点膜喷金仪将GNPs-apt 1 复合物以20 μL/cm2的速率喷涂到结合垫上，25 ℃烘箱烘干备用。

T、C 线的制备：分别将生物素修饰的适配体2（Bio-apt2）或生物素修饰的互补DNA 与链霉亲和素按摩尔比4:1 混合，即得到捕获探针和质控探针。利用点膜喷金仪将捕获探针和质控探针喷到硝酸纤维膜（NC 膜）上，分别作为检测线（T 线）和质控线（C 线），25 ℃烘箱中烘干备用。

试纸条的组装：将处理好的样品垫、结合垫、NC 膜和吸水垫依次黏贴于PVC 底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2 mm，T 线与C 线间隔距离为7 mm，用切条机切成4 mm 宽的试纸条，与干燥剂一起装于铝箔袋中密封保存备用。

1.3 试纸条性能测定

1.3.1 可视化检测限 将金黄色葡萄球菌用无菌SELEX 筛选缓冲液[18]（40 mmol/L Hepes（pH8.0）,5 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2,2 mmol/L MgCl2,150 mmol/L NaCl）进行梯度稀释，同时以SELEX 缓冲液设阴性对照，将制备好的试纸条插入200 μL 待测溶液中，5 min 后观察结果，将T 线完全消失前的菌液浓度定为肉眼可视化检测限。实验重复3 次。

1.3.2 特异性分析 将鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7、阪崎肠杆菌和痢疾志贺氏菌用无菌SELEX 缓冲液稀释成5×106CFU/mL的菌液，同时用SELEX 缓冲液作为阴性对照。将试纸条插入到200 μL的待测菌液中，5 min 后观察结果，分析试纸条的特异性。每个实验3 个重复。

1.3.3 实际样品检测 参照GB 4789.10-2016 执行[6]，称取25 g（mL）样品加入到盛有225 mL的7.5%氯化钠肉汤的无菌均质袋中，充分均质，置于（36±1）℃培养18～24 h，混匀。取50 μL 菌液用SELEX 缓冲液稀释4 倍，加入到酶标板中，将试纸条插入菌液，5 min 后判读结果。同时采用GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验[6]进行验证。

1.4 数据处理

每个实验重复测定三次，使用Origin 8.5 软件制图。

2 实验结果

2.1 纳米金质量鉴定

纳米金的大小及形貌对核酸偶联效率和检测灵敏度至关重要[27−28]，有研究报道，纳米金粒子直径一般在15～30 nm 比较合适[29]。T 线和C 线的颜色是由纳米金颗粒聚集到一定程度时形成肉眼可见的信号，若GNPs 粒径过小，产生的颜色较淡，影响试纸条灵敏度；粒径过大，位阻效应也相应增大，影响其在NC 膜上的流动性。从图1a 中可以看出，本研究制备的纳米金溶液呈晶莹透亮的酒红色，紫外光谱分析显示，金溶液最大吸收峰波长为520 nm，为纳米金的特征吸收峰。透射电镜表征结果显示（图1b），GNPs形貌为球型，粒径较为均一（约20 nm），分散性良好。

图1 纳米金紫外光谱图（a）和透射电镜图（b）Fig.1 Absorption spectra (a) and TEM images (b) of the synthesized GNPs

2.2 纳米金-适配体偶联物的表征

本研究采用4%琼脂糖凝胶电泳验证巯基化的适配体1 是否成功修饰到纳米金表面，如图2 所示，泳道1 为纳米金-适配体1 偶联物的条带，泳道2 为巯基化的金黄色葡萄球菌适配体1，可以看出纳米金-适配体1 偶联物的迁移率比适配体1 迟缓较多，因为金颗粒标记核酸适配体后，分子量增大，迁移速率变慢。综合以上，可初步判断巯基化的适配体1 成功偶联到纳米金表面。

图2 纳米金-适配体1 和适配体1的琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 The agarose electrophoresis of the GNPs-aptamer 1 and aptamer 1

2.3 适配体试纸条检测原理

所构建的适配体试纸条检测原理如图3 所示。当样品中有金黄色葡萄球菌时，目标菌和结合垫上包被的纳米金-适配体1 特异性结合，随着毛细管作用迁移到硝酸纤维素膜上，目标菌与T 线上包被的生物素化适配体2 结合，形成适配体1-目标菌-适配体2 夹心结构，纳米金在T 线沉积显色。纳米金-适配体1 继续层析至质控线（C 线），纳米金表面的适配体1 与C 线上的生物素化互补DNA 结合，纳米金沉积使C 线显色。如果样品中无目标菌，纳米金-适配体1 在T 线上不富集显色，继续层析迁移与C 线上的互补DNA 发生结合，C 线显色。

图3 基于适配体试纸条检测金黄色葡萄球菌原理图Fig.3 Schematic illustration of aptamer-based lateral flow strip for detection of S.aureus

2.4 试纸条制备和检测条件优化

2.4.1 NaCl 浓度的确定 在纳米金-适配体偶联物制备过程中，加入适当浓度的盐溶液“老化”处理，对提高适配体在纳米金表面的偶联效率至关重要[29]。本研究加入过量适配体（2 μmol/L），对照组不添加适配体，分别将实验组及对照组加入NaCl 溶液，使其终浓度分别20、40、60、80、100 mmol/L，然后采用目测法确定NaCl 浓度。结果如图4 所示，当NaCl浓度增加至80 mmol/L 时，对照组纳米金沉淀聚集，颜色变蓝，而实验组由于适配体覆盖在纳米体金表面，保护纳米金不团聚，纳米金溶液仍保持红色。故后续实验选择NaCl 浓度为80 mmol/L。

图4 NaCl 浓度优化Fig.4 Optimization of NaCl concentration by visual inspection

2.4.2 最小适配体偶联浓度的确定 在纳米金-适配体偶联物制备中，合适的适配体浓度对提高金溶液稳定性和检测灵敏度较为重要。如适配体浓度过低，当体系中有NaCl 存在时，适配体对纳米金起不到足够的保护作用，金溶液不稳定易沉聚变蓝，另外，若纳米金表面偶联的适配体较少，特异性结合靶标的数量也相应较少，进而影响检测灵敏度。本实验采用目测法确定纳米金标记最佳适配体浓度，分别向金溶液中加入不同浓度的适配体，室温孵育5 min 后加入NaCl溶液（终浓度80 mmol/L），选择金溶液仍保持红色的最小适配体浓度即为纳米金标记最小适配体用量。实验结果见图5，当适配体终浓度小于1 μmol/L时，金颗粒聚集变蓝，此时的适配体浓度不足以稳定纳米金溶液；当适配体终浓度≥1 μmol/L 时，胶体金溶液保持红色，表明此时纳米金-适配体体系较为稳定。因此，选择1 μmol/L 为稳定纳米金溶液的最小适配体浓度。

图5 适配体浓度优化Fig.5 The optimum of aptamer concentration by visual inspection

2.4.3 纳米金-适配体1 及捕获探针包被量的确定纳米金-适配体1（GNPs-apt 1）包被量对试纸条检测信号有较大影响[24]，包被量过多易导致背景信号提高，包被量太少，在高浓度的待测靶标条件下很容易饱和，导致T 线上的信号强度降低，影响检测灵敏度。本研究固定T 线捕获探针浓度为50 μmol/L，将GNPs-apt 1分别按1:1、1:2、1:4、1:6 体积比稀释，固定同等体积喷于结合垫上，检测5×106CFU/mL的金黄色葡萄球菌。结果如图6a 所示，随着纳米金-适配体1 浓度的降低，试纸条T 线显色逐渐变弱，当稀释倍数为1:4 时，检测信号明显变弱。因此，结合垫上GNPs-apt 1的稀释比例选择1:2。

图6 纳米金-适配体1（a）和捕获探针（b）包被浓度对T 线显色的影响Fig.6 Visual colorc hanges at the test lines with different concentrations of GNPs-aptamer 1 and capture probe

T 线上的捕获探针（链霉亲和素-生物素化适配体2）包被浓度影响与GNPs-apt 1的结合比例，最终影响试纸条的检测灵敏度。捕获探针包被浓度低，T 线显色不清晰，浓度高时易出现拖带现象。本研究将捕获探 针分别稀释 50、25、12.5、6.25、3.12 μmol/L，固定同等体积喷于硝酸纤维素膜上，检测浓度为5×106CFU/mL的金黄色葡萄球菌，比较T 线显色效果。从图6b 中可以看出，当捕获探针浓度小于25 μmol/L 时，T 线显色明显减弱，因此，捕获探针包被浓度选择25 μmol/L。

2.4.4 样品溶液对试纸条检测性能的影响 样品溶液的pH 和离子成分对适配体与目标物的结合有显著影响，因此最佳的运行缓冲液对试纸条检测性能至关重要。本实验分别采用SELEX 筛选缓冲液[18]、10 mmol/L PBS 缓冲液（8 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，1.44 g Na2HPO，pH7.4）、Tris 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L CaCl2、120 mmol/L NaCl、0.1% Tween-20,1% PEG 20000,2% 蔗糖，pH8.5）和无菌生理盐水稀释金黄色葡萄球菌，考察不同样品溶液对检测性能的影响。结果如图7 所示，选择SELEX 缓冲液作为样品检测溶液时，试纸条T 线显色信号最强，这可能与该适配体筛选时使用的缓冲液一致有关。有研究证明，改变适配体稀释溶液及离子强度可能影响适配体的三维折叠结构，进而影响靶标与适配体的识别及相互作用[30]。因此，后续实验选择SELEX 缓冲液作为样品检测溶液。

图7 样品溶液对适配体试纸条检测性能的影响Fig.7 The influence of sample solution on the detection performance of aptamer-based lateral flow strip

2.5 试纸条检测性能评估

2.5.1 可视化检测限 采用同一批次试纸条检测不同浓度的金黄色葡萄球菌ATCC6538，观察T 线显色信号，确定试纸条肉眼可视化检测限。结果如图8所示，随着金黄色葡萄球菌浓度的降低，试纸条上的检测信号逐渐减弱。当浓度为2×102CFU/mL 时，检测线肉眼完全不可见。因此，该适配体试纸条对金黄色葡萄球菌的裸眼可视化检测限为2×103CFU/mL。

图8 适配体试纸条灵敏度分析Fig.8 Sensitivity analysis of the aptamer-based lateral flow strip

2.5.2 试纸条特异性 采用本研究构建的试纸条分别检测相同浓度（5×106CFU/mL）的金黄色葡萄球菌ATCC 6538、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、大肠埃希氏菌O157:H7 ATCC25922、单增李斯特菌ATCC19155、阪崎肠杆菌ATCC29544、痢疾志贺氏菌，以确定适配体试纸条的特异性，结果如图9 所示，试纸条对两株金黄色葡萄球菌的检测结果为阳性，其他食源性致病菌的检测结果为阴性，表明该试纸条具有优良的特异性。

图9 适配体试纸条特异性分析Fig.9 Specificity analysis of the aptamer-based lateral flow strip

2.5.3 实际样品检测 为验证本试纸条的实用性和可行性，本实验选取畜禽肉、乳制品、凉拌菜等116个食品样品，分别采用国标法[6]和本方法进行检测。结果表明（表1），本方法检测结果与国标方法完全一致，肉制品和凉拌菜样品中金黄色葡萄球菌的检出率均为3.85%和3.33%。以上结果表明，该方法操作简单、检测快速、结果准确，适用于批量样品中金黄色葡萄球菌的快速定性检测，在食品安全快速检测方面具有良好的应用前景。

表1 本方法与国家标准方法检测结果对比Table 1 Comparison of detection results of the proposed method and the GB sandard method

3 结论

以核酸适配体为特异性识别分子，代替抗体构建了一种基于双适配体夹心模式的层析试纸条，在优化条件下（NaCl 浓度为80 mmol/L、适配体偶联浓度为1 μmol/L、结合垫上纳米金-适配体的稀释体积比为1:2、捕获探针浓度为25 μmol/L），该试纸条对金黄色葡萄球菌的可视化检测限为2×103CFU/mL，检测时间为5 min，在实际样品检测中，检测结果与国标方法完全一致。与传统的免疫胶体金试纸条相比，本方法识别分子可人工合成，故成本可大大降低。与基于适配体的其他快速检测方法相比[20−21]，本方法不需制备纳米材料和对适配体过多的功能化修饰，不需要特殊的专业设备。本方法具有操作简单、检测结果直观、准确性高等优点，为批量样品初筛和食品安全监管提供了新的技术支撑。