响应面法优化桑葚酵素食用凝胶的制备工艺

魏雪琴，陈美钰，游赵微，魏思艳，吴玉琼, ，庞 杰

（1.武夷学院茶与食品学院，福建武夷山 354300；2.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002）

益生菌发酵不仅能使植物的产品风味、质地、功效得到改善，而且能去除部分有害成分，增强益生功能[1]。其中，酵素（Jiaosu）是一种以植物或菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品[2]，其生物活性成分主要包括：维生素、蛋白质、氨基酸、多糖、寡糖、多酚、矿物质、酶及多肽等[3−4]。近年，酵素已在中国、日本及其他亚洲国家地区盛行[5]。据报道，酵素具有显著的抗氧化、抑菌、护肝、减肥等功效[6−9]。2019 年，国家发展和改革委员会将“酵素生产工艺技术开发及工业化、规范化生产”列入《产业结构调整指导目录（2019 年本）》鼓励类，作为新兴的功能性微生物发酵产品，酵素前景广阔。目前，酵素研究主要围绕其发酵工艺[10−12]、组分[13−15]、生物活性[16−18]以及菌种的分离、筛选与鉴定[19−21]等，而针对酵素开发新型功能性食品的研究相对较少[22−23]。

不同果蔬原料制得的酵素在理化品质和活性等方面均存在差异[24]。桑葚（Morus albaL.）味甜汁多，色泽鲜丽，含有丰富的营养物质和功能成分，是极具开发与利用价值的果实。目前，桑葚酵素的研制已见报道[25−27]。基于桑葚发酵液所具有的酸性及生物活性特征，桑葚酵素可为酸溶性凝胶基质的溶解提供条件，并具有作为功能性成分填充或包封于食品水凝胶中以提高食用凝胶营养价值的潜能。

凝胶化性质是多糖大分子生物功能的重要方面，在食品加工中，海藻酸钠、壳聚糖、卡拉胶等亲水胶体最重要的功能特性之一是其凝胶性，凝胶性不仅能够显著影响最终产品的质地和感官特性，而且能够改善产品功能性成分的不稳定性、生物活性和生物利用度。Li 等[28]利用海藻酸钠微凝胶包封从南酸枣果皮分离的原花青素组分获得良好包封率和释放特性；Yan 等[29]利用海藻酸钠与玉米醇溶蛋白作为凝胶剂制备可食用双交联乳液凝胶有效改善了姜黄素和白藜芦醇耐光性和生物有效性；Xie 等[30]将蓝莓花色苷与硫酸软骨素纳米复合物嵌入卡拉胶水凝胶中以提升蓝莓花色苷的稳定性。另外，利用多糖分子间协同相互作用可实现多糖的凝胶化，如聚阳离子壳聚糖与聚阴离子海藻酸钠在水溶液中可形成共混凝胶[31]。因此，本研究以食用壳聚糖、海藻酸钠、桑葚酵素为原料，利用钙离子的交联作用，制备桑葚酵素食用凝胶，通过单因素实验和响应面分析法优化酵素凝胶制备工艺，旨在为新型酵素功能食品开发提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚食用酵素 正果生物科技（上海）有限公司，理化品质相关指标分别为：总酸11.1 g/kg、粗多糖1.44 mg/mL、总黄酮0.27 mg/mL、总多酚0.35 mg/mL、总抗氧化能力88.49 U/mL；壳聚糖 食品级，源丰生物科技有限公司；海藻酸钠 分析纯，源叶生物科技有限公司；无水氯化钙 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

LLOYD-LS5 万能材料试验机 美国劳埃德；AE224 电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DF-101S 集热式磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；WP-UP-UV-20 电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；HJ-40SI 电动搅拌器常州高德仪器制造有限公司；Neofuge 15R 高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵素凝胶的制备 称取一定质量海藻酸钠，加水充分溶解后，取30 g 海藻酸钠溶液，于搅拌状态下与一定质量的壳聚糖和6.8 g 桑葚酵素混合，搅拌30 min，室温离心（10000 r/min）10 min。离心后的溶胶按5 g/份倒入聚苯乙烯培养皿（φ 6 cm），保鲜膜密封，置于4 ℃冰箱冷藏16 h 后，置于一定浓度的氯化钙溶液中固化交联一定时间[32]，获得桑葚酵素食用凝胶。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 海藻酸钠与壳聚糖质量比对酵素凝胶的影响 控制交联时间为60 min，氯化钙浓度为10 mg/mL条件下，将质量比设为5:2、5:3、5:4、5:5、5:6、5:7 进行实验，考察不同质量比对酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性等质构指标的影响。

1.2.2.2 交联时间对酵素凝胶的影响 基于1.2.2.1结果，即海藻酸钠与壳聚糖质量比为5:3，并控制氯化钙浓度为10 mg/mL 条件下，考察不同交联时间（30、60、90、120、150、180 min）对酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性等质构指标的影响。

1.2.2.3 氯化钙交联浓度对酵素凝胶的影响 基于

1.2.2.1 与1.2.2.2 结果，即海藻酸钠与壳聚糖质量比5:3，交联时间120 min 条件下，研究5、10、15、20、25、30 mg/mL的不同氯化钙浓度对酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性等质构指标的影响。

1.2.3 响应面试验设计 在单因素实验结果基础上，选取m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）（A）、交联时间（B）、氯化钙浓度（C）为自变量，以酵素凝胶的硬度、胶着性、咀嚼性等质构参数为响应值，采用响应曲面法中Box-Behnken Design（BBD）设计三因素三水平的优化试验。根据响应面试验设计结果，优化桑葚酵素凝胶最佳制备工艺。响应面试验因素水平编码表如表1所示。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factors and levels for response surface test

1.2.4 酵素凝胶质构的测试 采用万能材料试验机对酵素凝胶进行TPA（硬度、胶着性、咀嚼性）测定。测定前，将样品通过打孔器切割成φ 1.5 cm×2 mm的圆柱体。测定条件为：选择φ 38.1 mm的柱型压缩探头，预载应力为1 gf、预载/应力速度为2 mm/min，压缩速度为2 mm/min、回复速度为2 mm/min，压缩到样品高度的40%，两次压缩停顿持续时间为5 s。

1.3 数据处理

响应面设计和优化分析采用Design Expert 8.0.6 统计软件，实验数据整理与绘图采用Microsoft 2016 Excel。每组实验重复3 次，数据表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 海藻酸钠与壳聚糖质量比对酵素凝胶的影响在交联时间60 min，氯化钙浓度10 mg/mL 条件下，不同海藻酸钠与壳聚糖质量比对凝胶硬度、胶着性、咀嚼性的影响如图1 所示。由图1 可知，当m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）=5:2 时，酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性处于最小值；当海藻酸钠与壳聚糖质量比降至5:3 时，酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性均达到最大值，而后明显下降。这可能与天然聚阳离子壳聚糖与天然聚阴离子海藻酸钠之间的相互作用有关[33]。在桑葚酵素酸性环境中，壳聚糖中氨基质子化后带正电荷，当海藻酸钠与壳聚糖质量比较高时，壳聚糖分子链上的氨基与海藻酸钠的羧基静电相互作用力强，形成的复合凝胶结构致密，表现为较高的硬度、胶着性、咀嚼性；当复合体系中壳聚糖比例进一步增大，即海藻酸钠与壳聚糖质量比降低时，壳聚糖分子链上带正电的氨基相互排斥力增强，复合凝胶体系致密性下降，从而使质构参数降低。因此，优选海藻酸钠与壳聚糖质量比为5:3。

图1 海藻酸钠与壳聚糖质量比对酵素凝胶的影响Fig.1 Effect of mass ratio of sodium alginate to chitosan on Jiaosu gel

2.1.2 交联时间对酵素凝胶的影响 以m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）=5:3 为海藻酸钠与壳聚糖的最优质量比，进一步考察不同交联时间对酵素凝胶质构的影响，结果如图2 所示。由图2 可知，当交联时间为120 min 时，酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性均达到最大值。当交联时间小于120 min 时，凝胶硬度、胶着性、咀嚼性均随着交联时间的延长而增大，这是由于交联时间的延长使得海藻酸钠与钙离子之间进行充分的交联，凝胶变得更加致密，硬度、胶着性、咀嚼性随之增大；当交联时间大于120 min 时，凝胶硬度、胶着性、咀嚼性均呈下降趋势，这可能与凝胶吸水率增大有关[34]。因此，适宜的交联时间为120 min。

因循慎终追远式的反思，人类与外部世界及其自身关系的体认，已经掀开了人和自然矛盾冲突的面纱，触及如何审察人类生存危机的基本命题。伴随着“中心—边缘”物质关系交换谜题的交错起落，理论界面临着如何诠释人和自然、人和人、人和社会整体关系的全新论题。纵观思想风暴的中心区域，剥离人类中心主义“思想王权”的呼声跌宕起伏，添置自然中心主义“精神桂冠”的吁求不绝于耳。

图2 交联时间对酵素凝胶的影响Fig.2 Effect of crosslinking time on Jiaosu gel

2.1.3 氯化钙交联浓度对酵素凝胶的影响 在最优海藻酸钠与壳聚糖质量比5:3，交联时间120 min 条件下，不同氯化钙浓度对酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性的影响见图3 所示。由图3 可知，随着交联浓度逐渐增大，酵素凝胶的硬度、胶着性、咀嚼性呈现先增大后降低的趋势。当氯化钙浓度为20 mg/mL时，各质构指标均达到最大。因此，优选氯化钙交联浓度为20 mg/mL。

图3 氯化钙浓度对酵素凝胶的影响Fig.3 Effect of calcium chloride concentration on Jiaosu gel

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 回归模型建立及其方差分析 在单因素实验基础之上，以海藻酸钠与壳聚糖质量比（A）、交联时间（B）、氯化钙浓度（C）为试验因子进行三因素三水平Box-Behnken 试验设计，以酵素凝胶硬度（Y1）、胶着性（Y2）和咀嚼性（Y3）为响应值，结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

利用Design Expert 8.0.6 软件对上述试验结果进行二次回归拟合，得到酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性的二次回归方程如下：

a.酵素凝胶硬度回归方程：

对该回归模型进行方差分析，并对模型系数进行显著性检验，结果如表3 所示。由表3 可知，酵素凝胶硬度所建立的回归方程的模型的F值为19.60，P=0.0004<0.01，表明回归模型极显著；失拟性检验F值为5.61，P=0.0645>0.05，失拟项不显著，说明模型可接受，此模型可用于评估变量参数对酵素凝胶硬度的影响。多元相决定系数R2=0.9618，校正后=0.9128，说明所得模型预测值与硬度实际值相关性较好，可用于酵素凝胶工艺参数的预测与优化。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression models

b.酵素凝胶胶着性回归方程：

如表3 所示，酵素凝胶胶着性所建立的回归方程的模型：F值为20.38，P=0.0003<0.01，表明该模型极显著；二次模拟的失拟项F=4.87，P=0.0800>0.05不显著，说明模型可接受，可用于评估变量参数对酵素凝胶胶着性的影响。多元决定系数R2=0.9632，校正后=0.9160，说明所得模型可用于酵素凝胶工艺参数的预测与优化。

如表3 所示，酵素凝胶咀嚼性所建立的回归方程的模型：F值为19.35，P=0.0004<0.01，表明该模型极显著，二次模拟的失拟项F=5.90，P=0.0597>0.05 不显著，说明模型可接受，可用于评估变量参数对酵素凝胶咀嚼性的影响。多元决定系数R2=0.9613，校正后=0.9117，说明该模型可用于酵素凝胶工艺参数的预测与优化。

2.2.2 不同试验因素回归模型系数检验 表4 为各模型回归系数显著性检验结果。如表4 所示，在酵素凝胶硬度回归模型中，一次项C（P=0.0085<0.01）呈极显著，说明氯化钙浓度对酵素凝胶硬度影响极显著。根据F值可知，3 个因素对酵素凝胶硬度的影响大小排序为：C（F=13.11）>B（F=5.36）>A（F=1.38），即氯化钙浓度>交联时间>m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）。交互项AB（P=0.0459<0.05）达到显著，BC（P=0.0050<0.01）达到极显著，说明m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）与交联时间的交互作用对酵素凝胶硬度有显著影响，而交联时间与氯化钙浓度交互作用的影响则呈极显著。二次项A2、B2、C2均达到极显著水平（P<0.01），表明各因素对硬度响应值的影响不是简单的线性关系。

表4 回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression models

在酵素凝胶胶着性回归模型中，一次项B（P=0.0379<0.05）呈显著，C（P=0.0074<0.01）达到极显著，说明交联时间对酵素凝胶胶着性影响显著，氯化钙浓度对酵素凝胶胶着性影响极显著。根据F值可知，3 个因素对酵素凝胶胶着性的影响大小排序为：C（F=13.89）>B（F=6.52）>A（F=1.83），即氯化钙浓度>交联时间>m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）。交互项BC（P=0.0058<0.01）呈极显著，说明交联时间和氯化钙浓度之间的交互作用对酵素凝胶胶着性有极显著影响。二次项A2、B2、C2均达到极显著水平（P<0.01），表明各因素对胶着性响应值的影响不是简单的线性关系。

在酵素凝胶咀嚼性回归模型中，一次项B（P=0.0359<0.05）呈显著，C（P=0.0072<0.01）达到极显著，说明交联时间对酵素凝胶咀嚼性影响显著，氯化钙浓度对酵素凝胶咀嚼性影响极显著。根据F值可知，3 个因素对酵素凝胶咀嚼性的影响大小排序为：C（F=14.03）>B（F=6.71）>A（F=1.82），即氯化钙浓度>交联时间>m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）。交互项BC（P=0.0054<0.01）对方程有极显著影响，说明交联时间与氯化钙浓度之间的交互作用对酵素凝胶咀嚼性有极显著影响。二次项A2、B2、C2均达到极显著水平（P<0.01），表明各因素对咀嚼性响应值的影响不是简单的线性关系。

2.2.3 响应面交互作用分析与优化 根据二次回归方程模型分别对各因素间交互作用分别绘制以酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性为响应值的3D 响应曲面图，响应曲面图能反映两因素之间相互作用的强弱，3D 图中曲面的倾斜度越高，坡度越陡，说明两两因素交互作用越显著，结果如图4～图6 所示。

由图4a 可知，响应面的倾斜度高，坡度陡峭，当海藻酸钠与壳聚糖质量比不变时，随着交联时间的延长，酵素凝胶硬度呈先增后减的趋势；当交联时间不变时，随着m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）比值的增大，酵素凝胶硬度也呈先增后减的趋势；当m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）=5:2.66，交联时间达120 min 时，曲面达到最高点，等高线呈椭圆形，说明m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）与交联时间之间的交互作用对酵素凝胶硬度影响显著。由图4b 可知，当m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）=5:2.66，氯化钙浓度达20 mg/mL时，曲面达到最高点；由图4c 可知，交联时间与氯化钙浓度之间的交互作用对酵素凝胶硬度影响显著，当交联时间达120 min，氯化钙浓度达20 mg/mL，曲面达到最高点。

图4 两两因素交互作用对凝胶硬度影响的响应曲面图Fig.4 Response surface diagram of the interaction between two factors on the hardness of gel

如图5a 所示，当固定其中一个影响因素水平时，酵素凝胶的胶着性分别随着m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）和交联时间的增大呈先增后减的趋势，且当交联时间增加后，曲面变得更加陡峭，由此可见延长交联时间对凝胶胶着性的影响更加显著。由图5c 可知，响应面的倾斜度高，坡度陡峭，等高线呈椭圆形，说明交联时间与氯化钙浓度之间的交互作用对酵素凝胶胶着性影响显著，且当交联时间和氯化钙浓度增大后，曲面变得更加陡峭，说明交联时间和氯化钙浓度对凝胶胶着性的影响均显著，这与表4 回归模型方差分析的结果相一致。

如图6a 所示，在固定一个影响因素水平的情况下，酵素凝胶的咀嚼性分别随着m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）与交联时间的增加呈现先增加后减少的趋势。相对而言，当交联时间增加，曲面变得更加陡峭，由此可见交联时间对酵素凝胶咀嚼性的影响较m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）更为显著。由图6c 可知，响应面的倾斜度高，坡度陡峭，说明交联时间与氯化钙浓度之间的交互作用对酵素凝胶咀嚼性有显著影响，且交联时间和氯化钙浓度对凝胶胶着性的影响均显著，以上结果与表4 回归模型方差分析的结果相一致。

图6 两两因素交互作用对凝胶咀嚼性影响的响应曲面图Fig.6 Response surface diagram of the interaction between two factors on the chewiness of gel

由以上响应曲面图可知，响应值均存在最大值。因此，对上述试验因素范围内，选择响应值最大值进行优化，由二次回归方程求解得到酵素凝胶的最佳理论工艺条件为：m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）=5:2.82、交联时间为131 min、氯化钙浓度17.9 mg/mL，预测该条件下，酵素凝胶的硬度为7.56 N、胶着性为6.50 N、咀嚼性为0.67 kgf。

2.3 验证实验

为检验模型的可靠性，利用最优的预测实验条件，即m（海藻酸钠）:m（壳聚糖）=5:2.82、交联时间为131 min、氯化钙浓度17.9 mg/mL，进行3 次平行试验，得到实际凝胶的硬度为7.19 N、胶着性为6.60 N、咀嚼性为0.70 kgf，与模型理论值相对误差分别为4.9%、1.5%、4.5%，均在允许误差5%内[35]，说明该回归方程具有较高的可信度。因此，基于响应面法优化酵素凝胶制备工艺较准确可靠，可为实际生产提供参考。

3 结论

以壳聚糖、海藻酸钠及桑葚酵素为原料，通过钙离子的交联作用，制备酵素食用凝胶。通过单因素实验研究了海藻酸钠与壳聚糖质量比、交联时间、氯化钙浓度对酵素凝胶硬度、胶着性、咀嚼性等质构指标的影响。在此基础上，选取较优条件范围，通过响应曲面优化得到最佳工艺条件：海藻酸钠与壳聚糖质量比为5:2.82、交联时间为131 min、氯化钙浓度17.9 mg/mL。此优化条件下，酵素凝胶硬度为7.19 N、胶着性为6.60 N、咀嚼性为0.70 kgf，与模型所预测理论值相接近，具有实用价值。