羊肚菌多糖含片的研制及其体外抗氧化活性研究

王雪梅，龙叶峰，林勇涛，周楚升，孔泳欣，吴思英，周春晖

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广东广州 510030；2.广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东广州 510303）

羊肚菌（Morchella esculenta）别名羊蘑、羊肚菜、草笠竹，是世界上珍稀的食药用真菌之一，其香味独特、营养丰富，在我国主要分布在云南、四川、甘肃、陕西等地。多糖类组分是菌体中重要的生物活性物质，具有提高机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗疲劳、降血脂等功能[1]。

多糖常用提取方法有热水浸提法、酶解法、微波萃取法和超声波辅助提取法等[2−4]。酶解法常用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶破坏细胞壁和细胞膜，减少提取时细胞结构的阻力[5]。超声波破坏细胞壁的结构，加速多糖的溶出[6]。与热水浸提法相比，酶解法和超声辅助提取法提取羊肚菌多糖，提取得率更高。此外，酶解法作用条件温和，耗能低[7]，超声辅助提取法提取时间短、效率高[8]。使用纤维素酶和木瓜蛋白酶复合酶解可以提高多糖的溶出率和提取得率，将酶解与超声辅助两种提取方法结合起来进行二次提取，将更有利于提高羊肚菌多糖的提取得率。目前羊肚菌多以鲜食或加工成干制品为主，而将羊肚菌开发成功能性食品、保健食品等高附加值产品研究相对较少。付天宇[9]经羊肚菌深层发酵制备缓解体力疲劳、辅助降血脂的羊肚菌口服液；刘超[10]曾研究表明羊肚菌多糖的抗结肠癌的作用；田雨[11]制备了羊肚菌抗氧化肽。羊肚菌功效成分经提取后开发成新型功能性食品具有巨大的市场和发展前景。羊肚菌多糖含片，易于服用，便于携带，给工作节奏快、机体免疫力低下等人士提供一款体验感好的便利产品，丰富了羊肚菌健康食品的品类。

本文主要采用超声波辅助酶解法，以羊肚菌多糖的提取得率为指标，优化获得羊肚菌多糖的高效提取工艺，进一步实验得出羊肚菌多糖含片的最佳制备配方，以期为羊肚菌多糖功能性食品开发提供技术途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊肚菌子实体 购自云南省丽江市；纤维素酶（酶活力为10 万 U/g） 和氏璧生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力为10 万 U/g） 南宁庞博生物工程有限公司；菠萝蛋白酶（酶活力为10 万 U/g） 鑫诚生物科技有限公司；磷酸、苯酚、三氯乙酸 天津市永大化学试剂有限公司；三氯化铁 天津市百世化工有限公司；水杨酸、七水合硫酸亚铁 广州化学试剂厂；铁氰化钾 广州市番禺区建兴试剂厂；DPPH 试剂 上海金穗生物科技有限公司；30%过氧化氢 广州市海珠化学试剂有限公司；山梨糖醇河南万邦实业有限公司；乳糖、甘露醇 山东佰晨食品配料有限公司；硬脂酸镁 湖州市菱湖新望化学有限公司；维生素C 粉末 谷知味生物科技有限公司；95%乙醇溶液 河南鑫河阳酒精有限公司。

pH-100 笔式酸度计 上海力辰邦西仪器科技有限公司；电热恒温水浴锅、101-3AB 型电热鼓风干燥箱、FW177 型中草药粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；JJ500A 型分析天平 福建艾杰尔进出口有限公司；JY96-IIN 型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SC-3614 型高容量低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；RE-52A 型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；V-5100 型分光光度计上海元析仪器有限公司；Zp19 型旋转压片机 泰州市黎明制药机械有限公司；SY-3D 型片剂四用测定仪 广州市深华生物技术有限公司；BCD-331WDGQ型冰箱 青岛海尔股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羊肚菌多糖的提取

1.2.1.1 羊肚菌预处理 将羊肚菌子实体置于60 ℃的干燥箱中干燥3 h，然后将子实体进行粉碎并过20 目筛，干粉置于干燥器中储存备用。

1.2.1.2 羊肚菌多糖的提取 称取羊肚菌干粉2.00 g，参考陈超等[12]的方法，分别添加质量比为2:1的纤维素酶和木瓜蛋白酶，加去离子水，搅拌均匀，调节pH，置于55 ℃恒温水浴锅中酶解，酶解后分别进行150 W 超声处理，95 ℃灭酶，5000 r/min 离心15 min，上清液储存备用；将离心后的沉淀用相同体积的去离子水溶解，二次提取，离心得上清液；合并两次上清液，减压浓缩[13]，醇沉12 h[14]后，离心取沉淀、溶解，得到粗多糖溶液。

1.2.1.3 粗多糖的纯化 取粗多糖溶液，加入1%菠萝蛋白酶，加入1%活性炭，置于50 ℃恒温水浴锅中水浴1 h，6000 r/min 离心15 min，取上清液，即为羊肚菌多糖溶液。

1.2.1.4 羊肚菌多糖提取单因素实验 选择液料比、酶用量、酶解pH、超声时间与酶解时间为影响因素，以多糖提取得率为指标设计单因素实验，研究其对羊肚菌多糖提取得率的影响。设置单因素各因素的条件和范围如下：固定酶用量为1.4%、酶解pH 为5.5、超声时间15 min、酶解时间1.5 h，液料比分别为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g；固定液料比为15:1 mL/g、酶用量为1.4%、酶解pH 为5.5、超声时间15 min，酶解时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；固定液料比为15:1 mL/g、酶用量为1.4%、超声时间15 min、酶解时间1.5 h，酶解pH 分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；固定液料比为15:1 mL/g、酶解pH 为5.5、超声时间15 min、酶解时间1.5 h，酶用量分别为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%；固定液料比为15:1 mL/g、酶用量为1.4%、酶解pH 为5.5、酶解时间1.5 h，超声时间分别为10、15、20、25、30 min。

1.2.1.5 响应面优化羊肚菌多糖提取工艺 根据单因素实验的结果挑选出影响羊肚菌多糖提取得率的显著因素，分别为液料比、酶解pH、超声提取时间，以这三个因素为响应面优化因素，以羊肚菌多糖的提取得率为响应值，采用Design-Expert 8.05 软件设计响应面试验[15]响应面的因素和水平见表1。

表1 羊肚菌多糖提取工艺响应面优化试验因素水平设计Table 1 Factors and levels table of optimization experiment of Morchella esculenta polysaccharide extraction process by response surface methodology

1.2.2 羊肚菌多糖提取得率的测定

1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 准确配制0.004、0.008、0.012、0.016、0.020、0.024、0.028 mg/mL的葡萄糖溶液，分别移取2 mL 不同浓度的葡萄糖溶液至试管中，并加入现配的6%苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，静置30 min，每组实验设置三个平行，以空白组为参比溶液，490 nm 测吸光度，绘制标准曲线，得出回归方程。

1.2.2.2 换算因子的测定 准确配制0.01 mg/mL的羊肚菌精多糖溶液，按照1.2.2.1 方法测量，得到结果根据回归方程计算出精多糖溶液中葡萄糖的含量，并根据以下公式计算换算因子f。

式中，C 表示精多糖中葡萄糖的浓度，mg/mL；D 表示溶液的稀释倍数；m 表示精多糖的质量，g。

1.2.2.3 多糖提取得率的测定 结合苯酚-硫酸法[16]测定多糖提取得率：将提取得到的羊肚菌多糖溶液定容到50 mL的容量瓶中、准确吸取2 mL 并定容到100 mL的容量瓶中，按照1.2.2.1 方法测量，并根据以下公式计算多糖提取得率。

式中，C 表示多糖溶液中葡萄糖的浓度，mg/mL；D 表示溶液的稀释倍数；V 表示定容的体积，mL；f 表示换算因子；m 表示羊肚菌粉末质量，g。

1.2.3 羊肚菌多糖含片的制备

1.2.3.1 羊肚菌多糖含片的制备 参考刘梁等[17]的方法并加以改良，将最优提取条件下获得的羊肚菌多糖溶液浓缩成浸膏，后加入填充剂和维生素C 混合，过14 目筛网制粒，置于60 ℃烘箱中干燥3 h，过20 目筛网整粒，加入硬脂酸镁总混，旋转压片机压片，即得羊肚菌多糖含片。

1.2.3.2 含片制备单因素实验 填充剂的选择：分别比较乳糖、甘露醇、山梨糖醇、甘露醇与山梨糖醇混合物（1:1）四种填充剂[18]，按照1.2.4 中的方法进行综合评价选出最佳填充剂。

填充剂的用量：根据上述实验结果，选择填充剂与多糖浸膏的质量比为6:1、8:1、10:1、12:1、14:1，按照1.2.4 中的方法进行综合评价确定最佳用量。

硬脂酸镁的用量：比较不同硬脂酸镁的添加量为总质量的0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，按照

1.2.4 中的方法进行综合评价确定最佳用量。

维生素C的用量：比较维生素C的添加量2、3、4、5、6 g/kg，按照1.2.4 中的方法进行综合评价确定最佳用量。

1.2.3.3 含片制备正交试验 在单因素实验的基础上，选取填充剂山梨糖醇与甘露醇混合物（1:1）、硬脂酸镁用量和维生素C 用量三个因素进行正交试验。以此确定填充剂与多糖的最佳比值、硬脂酸镁和维生素C的最佳用量。根据单因素实验的结果，设置三因素三水平正交试验，见表2。

表2 羊肚菌含片正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels tabke of orthogonal experiment of Morchellabuccal tablets

1.2.4 含片综合评价 邀请20 名具有丰富经验的感官评价员，分别从含片的风味、口感、组织状态、色泽四个方面进行评分鉴定。风味、口感各占30 分，组织状态占25 分，色泽占15 分，满分100 分[19]，评价标准见表3。以感官评价70 分、硬度15 分、脆碎度10 分、崩解时限5 分、总分100 分为综合评分指标，对含片进行综合评价，综合评价表见表4。

表3 感官评价标准表Table 3 Sensory evaluation standard table

表4 含片综合评价表Table 4 Comprehensive evaluation table of buccal tablets

1.2.5 含片质量检测

1.2.5.1 片重差异的测定 按照2020 年版《药典》片剂章节所述方法测定。

1.2.5.2 多糖含量的测定 使用苯酚-硫酸法测定。

1.2.5.3 硬度的测定 制备三个批次的含片，每批次随机选出二十颗，使用片剂四用测定仪测定。

1.2.5.4 脆碎度的测定 取20 片样品吹去表面粘附的粉末并称量其质量A，置于片剂四用测定仪中4 min转动100 r，结束后取出吹去表面的粉末并称量其质量B，按照以下公式计算脆碎度。

式中，A 表示检测前质量，g；B 表示检测后质量g；

1.2.5.5 崩解时限测定 利用量筒静态法[20]测定，将羊肚菌多糖含片放入盛有2 mL 去离子水的10 mL量筒中，水温37 ℃，放入含片后开始计时，观察含片至没有崩散现象停止计时，记录崩解时长。

1.2.6 含片抗氧化活性研究

1.2.6.1 羟自由基清除能力测定 参考Opa 等[21]的方法并加以改良，精确配制9.0 mmol/L的水杨酸溶液、9.0 mmol/L的硫酸亚铁溶液、9.0 mmol/L的过氧化氢溶液，和不同浓度的样品溶液（0.02、0.2、2、4、8、10 mg/mL），准确移取不同样品溶液2 mL 于试管中，准备空白组，并分别向每管溶液中准确移取2 mL 硫酸亚铁溶液、过氧化氢溶液、水杨酸溶液，37 ℃的恒温水浴30 min，用去离子水作参比溶液，510 nm 测其吸光度，每组实验设置三次平行，以维生素C 作为阳性对照，得到结果按照以下公式计算：

式中，Ax表示样品清除羟自由基后的吸光值；Axo表示样品本身的吸光值；Ao表示空白组的吸光值。

1.2.6.2 清除DPPH 自由基实验 参考Ma 等[22]的方法并加以改良，准确配制0.05 mg/mL的DPPH 溶液、0.02、0.2、2、4、8、10 mg/mL的样品溶液，准确移取2 mL 不同浓度样品溶液于试管中，分别加入4 mL 浓度为0.05 mg/mL的DPPH 溶液，避光反应30 min,以去离子水为参比溶液，517 nm 测其吸光度值，每组实验设置三次平行，以维生素C 作为阳性对照，结果按以下公式计算：

式中，Ax表示样品清除DPPH 自由基后的吸光值；Axo表示样品本身的吸光值；Ao表示空白组的吸光值。

1.3 数据处理

响应面试验数据使用Design-Expert 8.05 软件处理，正交实验数据使用正交助手Ⅱ v3.1 软件处理，其他数据使用Excel 2010 处理。

2 结果和分析

2.1 检测羊肚菌多糖含量

2.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制 以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，结果见图1。

图1 葡萄糖溶液的标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose solution

由图1 可知，葡萄糖标准曲线回归方程为：y=16.286x−0.0271，R2=0.997，吸光度值和多糖浓度在0～0.028 mg/mL 之间具有良好的线性关系，代入精多糖的吸光度求出换算系数f=1.23，将其代入提取得率公式即可计算出提取得率。

2.2 羊肚菌提取单因素实验

2.2.1 液料比对羊肚菌多糖提取得率的影响 液料比对羊肚菌多糖提取得率的影响如图2 所示，随着液料比的上升，羊肚菌多糖的提取得率先上升后下降，当液料比在10:1～25:1（mL/g）之间呈上升趋势，液料比达到25:1（mL/g）时，提取得率达到最大值9.28%，当液料比大于25:1（mL/g）时，提取得率呈现下降趋势，原因可能是，液料比大于25:1（mL/g）时，加入的蒸馏水多，稀释了酶的浓度。实验得出可将液料比为20:1～30:1（mL/g）列为进一步优化的范围。

图2 液料比对羊肚菌多糖提取得率的影响Fig.2 Effect of liquid-material ratio on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.2 酶解时间对羊肚菌多糖提取得率的影响 酶解时间对羊肚菌多糖提取得率的影响如图3 所示，随着酶解时间的延长，羊肚菌多糖提取得率呈先上升后下降的趋势，当酶解时间低于2 h 时，多糖的提取得率逐渐上升，当酶解时间为2 h 时，羊肚菌多糖的提取得率达到最大值8.55%，大于2 h 时，羊肚菌多糖的提取得率呈下降趋势。其原因有可能是酶解时间的延长，使得酶开始失活，且多糖结构发生降解，导致提取得率下降[23]，由此可得适宜的酶解时间为2 h。

图3 酶解时间对羊肚菌多糖提取得率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.3 酶解pH 对羊肚菌多糖提取得率的影响 酶解pH 对羊肚菌多糖提取得率的影响如图4 所示，随着酶解pH的增大，羊肚菌多糖提取得率呈先上升后下降的趋势。当酶解pH 小于5.0 时，羊肚菌多糖的提取得率呈上升趋势，当酶解pH 等于5.0 时，羊肚菌多糖提取得率达到最大值9.57%,当酶解pH 大于5.0 时，羊肚菌多糖的提取得率下降，其原因可能为pH 影响酶的活性。由此可得最佳酶解pH 为5.0，据研究，纤维素酶最适pH 为4.5～6.0，木瓜蛋白酶最适pH 为5.0～7.0，因此该pH 为5.0 时效果较好与两种酶的最适pH 具有一致性。

图4 酶解pH 对羊肚菌多糖提取得率的影响Fig.4 Effect of pH on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.4 酶用量对羊肚菌多糖提取得率的影响 酶用量对羊肚菌多糖提取得率的影响如图5 所示，随着酶用量增大，羊肚菌多糖提取得率呈现上升趋势。当酶用量为1.4%，羊肚菌多糖提取得率达到8.48%；当酶用量少于1.4%时，羊肚菌多糖的提取得率呈现快速上升趋势；当酶用量大于1.4%时，羊肚菌多糖提取得率呈缓慢上升趋势，其原因可能是当酶用量达到一定量时，底物大部分被反应完，故提取得率上升趋势极缓慢，结合成本考虑，确定酶用量为1.4%。

图5 酶用量对羊肚菌多糖提取得率的影响Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.5 超声波处理时间对羊肚菌多糖提取得率的影响 超声波处理时间对羊肚菌多糖提取得率的影响如图6 所示，随着超声波处理时间的延长，羊肚菌多糖提取得率呈现先上升后下降的趋势，当超声波处理时间少于20 min 时，羊肚菌多糖的提取得率呈现上升趋势，当超声波处理时间为20 min 时，羊肚菌多糖提取得率达到最大值8.51%,当超声波处理时间大于20 min 时，羊肚菌多糖的提取得率下降，原因可能是超声时间过长，多糖链的结构被破坏，导致提取得率下降[24]。由此可得超声波较优的处理时间为20 min。

图6 超声波处理时间对羊肚菌多糖提取得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.3 羊肚菌提取响应面优化试验结果

2.3.1 响应面优化试验结果 对响应值进行多元回归拟合[25]，得到多糖含量与各因素的二次多项回归方程，提取得率Y=9.28+0.34A−0.069B−0.23C+0.21AB+0.26AC−0.28BC+0.26AC−0.28BC−0.24A2−0.32B2−0.50C2，R2=0.9323。试验设计及结果见表5。

表5 响应面试验设计及结果Table 5 Design and results of response surface test

F值越大表明该因素对含量影响越显著，各因素对羊肚菌多糖含量的影响大小依次为：A-液料比>C-超声时间>B-酶解pH。其中A、C、AC、BC、A2、B2、C2为显著性因子项。对模型进行显著性检验，模型的F为10.70，P<0.01，模型因子具有极显著性意义。该模型的失拟项F为0.77，P>0.05，无显著性差异，回归方程与实际拟合的非正常误差所占的比例较小，能反映实际情况，说明是可靠的、合适的、有意义的表6。

表6 回归方程方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equation

2.3.2 响应面图及等高线图分析 通过响应面试验得到多元二次回归模型所作响应面图和等高线图如图7 所示，对回归模型进行分析，得到羊肚菌多糖提取的最佳工艺为：液料比为28.62:1（mL/g）、酶解pH 为5.08、超声波处理时间为19.55 min，此工艺下羊肚菌多糖提取得率为9.40%。为方便操作，将羊肚菌多糖的提取工艺修改为:液料比29:1（mL/g）、酶解pH 为5.1、超声波处理时间20 min。经实验验证，羊肚菌多糖得率为9.21%，此工艺优化效果明显。

图7 不同两因素交互作用对羊肚菌多糖提取得率影响的响应面图及等高线图Fig.7 Response surface diagram and contour map of the interaction of different two factors on the extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.4 含片制备单因素实验结果

2.4.1 填充剂的选择对含片的影响 四种填充剂均不粘冲、片剂成形情况均良好。但乳糖和甘露醇的吸湿率低，成型的片剂太硬，不利于含服融化。山梨糖醇吸湿率高，成型的片剂脆碎度相对较高，易掉粉。结合乳糖不耐受症患者由于体内缺乏乳糖酶导致不能消化吸收乳糖而不宜食用[26]，故确定填充剂为山梨糖醇:甘露醇=1:1 组合，压出来的片剂硬度适中、口感好、适用人群较广，且糖醇类不易引起龋齿，不会大幅度引起血糖的上升。在湿度较低的干燥环境下所测得填充剂吸湿率如图8 所示，综合得分如图9 所示。

图8 不同填充剂的吸湿曲线图Fig.8 Moisture absorption curves of different fillers

2.4.2 山梨糖醇、甘露醇混合物与多糖浸膏的比值对含片的影响 山梨糖醇、甘露醇混合物与多糖浸膏的比值对含片的影响如图10 所示，随着比值的增大，含片的综合得分呈现先上升后下降的趋势，当比值为8:1 时，综合得分达到最大，比值大于8:1 时，综合得分下降，原因可能在于多加的填充剂降低了多糖的浓度，降低了含片的功能性。由此可得最佳山梨糖醇、甘露醇混合物与浸膏比值为8:1。

图10 山梨糖醇、甘露醇混合物与多糖浸膏比值综合评分图Fig.10 Comprehensive score chart of ratio of sorbitol,mannitol mixture and polysaccharide extract

2.4.3 硬脂酸镁的添加量对含片的影响 硬脂酸镁的添加量对含片的影响如图11 所示，随着硬脂酸镁添加量的增大，含片的综合得分呈现先上升后下降的趋势，当添加量为1.0%时，综合得分达到最大，添加量大于1.0%时，综合得分下降，原因可能在于硬脂酸镁的添加量过大，影响了含片的崩解时限。

图11 硬脂酸镁添加量对含片的综合评分图Fig.11 Comprehensive score chart of magnesium stearate addition on buccal tablets

2.4.4 维生素C的添加量对含片的影响 维生素C 添加量对含片的影响如图12 所示，随着维生素C 添加量的增大，含片的综合得分呈现先上升后下降的趋势，当添加量为4 mg/g 时，综合得分达到最大，当添加量大于4 mg/g 时，综合得分下降，原因在于维生素C的添加量增加引起口感的变化，含片变酸。

图12 维生素C 添加量对含片综合评分图Fig.12 Comprehensive score chart of vitamin C addition on buccal tablets

2.5 含片制备正交实验结果

由表7 可知，3 个因素对结果影响的大小为A>B>C,即填充剂与多糖的比值>维生素C的添加量>硬脂酸镁的添加量，填充剂与浸膏的比值对含片整体的影响最大，硬脂酸镁的添加量对含片整体的影响最小。最优组合为A2B3C1,最佳的制备工艺为填充剂与多糖的比值为8:1、维生素C的添加量5 mg/g、硬脂酸镁的添加量为0.8%。

表7 含片正交实验结果表Table 7 Orthogonal test results of buccal tablets

2.6 含片质量检测结果

多糖含片片重差异为3.2%（低于5%）、脆碎度为0.5%±0.1%，两项指标符合2020 年版《中国药典》的标准；羊肚菌多糖含量为8.5%±0.5%；崩解时限为12 min、硬度为（126.4±3.0）N，该两项指标 在2020 年版《中国药典》中未做规定，主要影响到产品得分综合评价，测量值符合评分要求。

2.7 抗氧化活性研究结果

2.7.1 清除羟自由基实验 羟基自由基（·OH）清除能力测定：如图13 所示，在羊肚菌多糖含片浓度0.02～10 mg/mL的范围内，羊肚菌多糖含片对·OH的清除率随浓度的增大而不断增大，呈现一定的量效关系，羊肚菌多糖含片10 mg/mL 时对羟自由基清除率高达46.78%，研究结果表明，羊肚菌多糖含片有良好的羟自由基清除能力。含片中作为辅助原料的维生素C，在样液中的浓度远低于阳性对照维生素C的浓度（浓度比为1:200），因此，含片对羟自由基的清除能力主要是羊肚菌多糖的作用，配方中维生素C 或起到一定的协同效果。

图13 羊肚菌多糖含片和维生素C 对羟自由基的清除能力Fig.13 Scavenging ability of Morchella esculenta polysaccharide buccal tablets and vitamin C on hydroxyl radical

2.7.2 清除DPPH 自由基实验 DPPH 自由基清除能力测定：如图14 所示，羊肚菌多糖含片浓度在0.02～10 mg/mL的范围内，对DPPH 自由基的清除率随浓度增大而增大，呈现一定的量效关系，表现出稳定的清除能力。当羊肚菌多糖含片浓度为10 mg/mL时，清除率达到75.38%，证明多糖含片有极好的清除DPPH 自由基的能力。同理，含片对DPPH 自由基的清除能力主要是羊肚菌多糖的作用。

图14 羊肚菌多糖含片和维生素C 对DPPH 自由基的清除能力Fig.14 Scavenging ability of Morchella elculenta polysaccharide buccal tablets and vitamin C on DPPH free radicals

3 结论

羊肚菌多糖提取中，设置单因素实验，通过分析方差挑选出3 个对提取得率影响较显著的因素进行响应面优化处理，得到最终的结果为液料比29:1 mL/g、酶解pH 为5.1、超声波处理时间20 min、酶解时间为2 h、酶用量为1.4%；制备含片部分，设计单因素实验挑选出最佳的填充剂、填充剂和提取物的适用量、维生素C的适用量、硬脂酸镁的适用量，并在此基础上设计三水平三因素正交试验，探索出各因素最佳用量，最终配方为：填充剂为山梨糖醇:甘露醇=1:1 混合粉末，填充剂与多糖提取物比值为8:1，维生素C的使用量为5 mg/g，硬脂酸镁的用量为0.8%；在检测部分所得结果如下：含片的pH 为6.3±0.1，硬度为（126.4±3.0）N，脆碎度为0.5%±0.1%，崩解时限为12 min，多糖含量（31.4±0.5）mg/粒，含片浓度为10 mg/mL 时，羟自由基清除率为46.78%，DPPH 自由基的清除率为75.38%，抗氧化活性良好。本研究对高效提取羊肚菌多糖并加工成易于携带、便于进食、口感优良的羊肚菌多糖功能食品，具有一定的参考价值，后续可以在功能机理上作更深入的研究；同时也可以将羊肚菌多糖在其他保健功能如缓解疲劳、预防肿瘤等功能产品的开发与应用上做更广泛的研究与探讨。