分离过程对血袋外周血采集单个核细胞的影响及结果验证

潘纪春, 马晓芬， 刘旭功， 林侯汎， 陈民才

(1.解放军总医院 第三医学中心, 北京 100131; 2. 北京恒生佳合细胞科技有限公司, 北京 100176)

免疫治疗法是近代医疗史上一个重要的里程碑，其特点是具有个体专一性及病原针对性，其所需的研究材料通常是来自自体血液内外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。此细胞群是指外周血中具有单个核的细胞，主要包含T淋巴细胞(T lymphocytes)、B淋巴细胞(B lymphocytes)、单核细胞(Monocytes)、自然杀伤细胞(natural killer cells)、树突状细胞(dendritic cells)以及造血干细胞(hematopoietic stem cells)等，是免疫系统的重要组成部分，是机体完成免疫反应的重要基础[1]。目前，PBMC常用的分离方法很多，其中，Percoll非连续密度梯度离心法和葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度离心法是最常应用的分离方法[2-3]。分离出的PBMC多种细胞各有不同功能，可以进行定向扩增，或基因修饰为日后的免疫治疗打下基础。

具体而言，此类研究首先需要大量从外周血中分离 PBMC，这就要求PBMC的分离提取与纯化工艺操作精简省时。新鲜血液采集后，血样容量较大，无菌分离PBMC时，需要大量离心管分离离心，烦琐且重复地开放性操作容易导致污染。如果用血袋来大量采集血液，再将红细胞与白细胞分离，不仅可以提供红细胞给需要的患者，同时还可取得大量的PBMC样本并精简初期的操作。目前，为避免排斥反应，献血站所取得的捐献血液都是将白细胞丢弃，如果可以将此重要的医疗资源保留起来，无论是作为医学研究还是免疫治疗，这些单核细胞都大有用途，可转化为重要的稀缺医疗资源。

血袋分离操作首先需要使用高速冷冻离心机从血袋中分离出红细胞和含少量红细胞的白膜层[4](Buffy coat， 其内含有大量的PBMC)，再经过葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度离心法以适当的离心参数分离PBMC。根据全血中不同血细胞的密度以及密度梯度离心法的原理, 经过多次尝试, 探索出适用于从大量血液中分离PBMC操作的方法: 即通过实验对比分析，找出最佳的分离方法。之后，将所得到的PBMC冻存到气相液氮罐中，定期取出进行培养，并确认PBMC的生物活性。

1 实验方法

1.1 外周全血第一次分离

采集健康献血者新鲜外周全血400 mL于采血袋中，血样均符合伦理且取得供者知情同意。将血袋置于高速冷冻离心机(美国Thermo公司， 型号Cryofuge 6000i)中，初次分离成分血，包括红细胞、血小板、血浆、白细胞。每一献血者再分别采集5 mL外周全血于肝素钠抗凝管中，行血常规检测。根据离心力的不同，试验共分成3个组，每组取3份外周血：A组，2 800 r/min(2 516g)；B组，3 500 r/min(3 931g)；C组，4 000 r/min(5 134g)。设置离心机升速为9，降速为7，温度为4 ℃，各组分别离心10 min。离心结束后，记录血袋中白细胞层的状态，同时，将白细胞层挤压入新的血袋中，用热合机密封导管。

1.2 白细胞层第二次分离

在生物安全柜中，将A组、B组、C组3组所得白细胞全部倒入50 mL离心管中，记录每份白细胞的体积，于2 000 r/min离心10 min，吸弃血浆层，向所得细胞共加入适量无菌生理盐水，重悬细胞成单细胞悬液。将稀释后的细胞缓慢加入50 mL离心管中15 mL Ficoll淋巴细胞分离液上层，使细胞悬液与淋巴细胞分离液体积比为2∶1。所有50 mL离心管于水平离心机(美国Thermo公司，型号ST40R)中离心10 min，按照离心机转数的不同，分成3组：第1组转数为1 500 r/min(526g)；第2组转数为1 800 r/min(757g)；第3组转数为2 000 r/min(935g)。设置离心机升速为4，降速为4，温度为4 ℃，各组分别离心20 min。离心结束后，记录50 mL离心管中白膜层的状态。分别吸取白膜层加入新的50 mL离心管中，补加PBS缓冲液至45 mL，于1 800 r/min离心5 min，细胞共清洗3次。清洗结束后，每支离心管中加入45 mL PBS缓冲液，重悬细胞成单细胞悬液。

1.3 细胞数量检测

在生物安全柜中，混匀含白细胞层的血袋，每一份血袋均用10 mL无菌注射器吸取5 mL细胞悬液，加入5 mL无菌样品管中，于DH-510全自动无分类血球计数仪进行检测，根据检测结果计算白细胞、红细胞、中性粒细胞和血小板总数，以及白细胞回收率，红细胞、中性粒细胞和血小板残留率。以白细胞为例，算式如下:白细胞总数=白细胞计数浓度×白膜血体积，白细胞回收率=白细胞总数/(原血白细胞浓度×献血体积)。

白细胞层第二次分离结束后，沿着离心管壁吸取白膜层于两支新的50 mL离心管中，补足无菌生理盐水至50 mL，于1 500 r/min离心5 min。倒掉上清液后，两支离心管中细胞合并至一管，补足50 mL无菌生理盐水，重悬细胞，于1 500 r/min离心5 min，共离心清洗3次。清洗结束后，加入45 mL无菌生理盐水，重悬细胞成单细胞悬液，于DH-510全自动无分类血球计数仪进行检测，根据检测结果计算单个核细胞总数、细胞活率与回收率，红细胞、粒细胞和血小板总数与残留率。

1.4 PBMC 冻存

根据计数仪计数结果换算出细胞实际数量，按照2.0×107cells/管，冻存细胞(冻存工作液;ExCellBio OptiVitro©)。

1.5 细胞培养扩增

细胞复苏后, 根据PBMC细胞计数，向单个核细胞中添加相应体积X-VIVO15 培养基(含1 000 U/mL IL-2)，调整细胞浓度为3.0×106/mL，根据所添加的细胞体积量，向单个核细胞悬液中加入重组人IFN-γ，使其终浓度为1 000 U/mL，加入5%自体血浆。培养瓶置于37 ℃、5%CO2培养箱进行培养。培养24 h后取出培养瓶，向培养瓶中补加等量体积的X-VIVO15(含1 000 U/mL IL-2) 培养基，根据总体积量，再加入相应体积5%自体血清，将细胞浓度调至2.5×106～3×106/mL，再向细胞中加入白介素-1α其终浓度为1 000 U/mL、CD3至其终浓度为1 μg/mL。将培养瓶放回37 ℃、5%CO2培养箱继续培养。72 h后取出培养瓶，向培养瓶中补加等量体积的X-VIVO15 培养基(含1 000 U/mL IL-2)，再加入相应体积2%自体血清，继续培养。每天观察培养的细胞，每隔2～3 d，培养基颜色变黄时补充相应体积X-VIVO15 培养基(含1 000 U/mL IL-2)和2%自体血清一次，直至细胞收集，通常15～18 d收获。

1.6 数据统计分析

2 结果

血袋经离心后，首先压出上清血浆，再来以目测的方式收集白膜层部分的血浆，收集后测量每份的体积与其内的细胞浓度。每份白细胞层的体积与数量见表1，根据A、B、C 3组中每份白细胞层测得的白细胞密度与体积计算获得的白细胞总数。 由结果得知，初步离心时的转数并非越高越好。在较高的转速离心时，虽然可以明显集中肉眼所观察到的白细胞的分离层，减少收集的体积，但分析后发现在较高的转速条件下，白细胞数量并不如预期。这或许是因为未部分白细胞可能下降到红细胞层的部分而没有被收集。

表1 第一次离心结果

以血球计数仪分析全血内的细胞总数之后，在与所收集的白膜层数据(表1)进行比对，数据分析说明，白膜血中分离所得到的白细胞从细胞总数和细胞回收率而言，A组和B组均高于C组且差别均具有统计学意义，而A组和B组之间的差别并无统计学意义，显示初步离心分离可以采用A组或B组参数，但A组在数据均略高于B组，故而采用2 800 r/min优于3 500 r/min。此结果也说明在较低速离心的条件下，即使白膜层与红细胞层的界面分离不明显，但却可以取得更多的白细胞。反之，在高速离心时，白细胞可能因为过度聚集而容易造成不均，且会下沉到红细胞层而没有被收集到。

在较高的速度离心条件下，各细胞层的分离界面会变得清晰。接下来探讨是否会影显白膜层内红细胞的收集量。表2所示的数据分析说明，分离所得白细胞中的红细胞从残留密度、残留总数和残留率而言，C组显著低于A组和B组，而A组和B组在残留总数和残留率方面无差别。A组与B组比较，P>0.05，两组数据差别无统计学意义；A组与C组比较，P<0.01，两组数据差别具有显著统计学意义;B组与C组比较，P<0.01，两组数据差别具有显著统计学意义。

表2 白膜层内红细胞残留量

这说明在较高的转速下，细胞分层界面清晰有助于红细胞的分离，因此在采血站去白细胞的过程中可以选择较高的离心速度，以期能最大量保留红细胞。但如果是为了收集PBMC或许较低的转数会是一个比较好的分离条件。

血细胞成分中的血小板除了凝血之外还具有多种功能，其中帮助细胞增生及促进组织修复这部分也逐渐地受到各方重视。所以在不同离心转数之下的分离状况也做了分析。如表3所示，在低转数的条件下，可以最大量取得血小板数，所取得的血小板残留率甚至可以高达98.5%。但结果也显现当离心力超过4 000g时，血小板残留率突降至50%以下。此一实验数据显示当离心力超过4 000g时，血小板在血袋内将开始移至红细胞层内，而导致取得困难。

表3 血小板数量分析

综合上述初步离心后所得数据说明，A组和B组分离获得的白细胞各方面均优于C组，且A组更优于B组；虽然A组和B组获得的白细胞中残留的中性粒细胞、红细胞和血小板方面的残留均明显高于C组，但这些组分均可以通过进一步的分离进行纯化。因此，初步分离白膜血采用2 800 r/min最佳。因此，后续的实验是以血袋离心2 800 r/min后所得到的结果。

PBMC内含多种细胞，其中目前被作为免疫细胞治疗的种子细胞就是单个核细胞。分离后得到单个核细胞越多，后续实验的可能性便越大。第2次离心后取出白膜层并进行数据分析。得到结果显示，第2次分离时不同离心力对分离的效果并无统计学上的意义。这可能是因为与初次离心不同点在于第2次离心所添加的淋巴球分离液是固定的密度，利用不同血细胞有不同密度的特性，将血细胞分离开来，所以受离心力的影响较小。换句话说，第2次离心所使用的淋巴球分离液的品质与体积反而是比较重要的一环。

与常见的PBMC分离方式不同点在于用血袋分离的处理时间较长，离心次数较多。因此，接下来检测经过多次离心后，在最后的单个核细胞存活率是否会降低。其结果如图1所示，在经过多次离心后，不同的离心转数下，单个核细胞的活率都有95%以上。如此证明在这样的条件下细胞并没有受到太大的损伤。

图1 单个核细胞活率

同时也对第2次离心时不同离心力的条件下其白膜层内的红细胞及血小板数量进行分析。其结果显示(图2)，在第2组内的红细胞数量较高，而第1组的红细胞残留量是最低的。

图2 第2次离心后白膜层内红细胞、血小板残留率

综合上述实验得知1组、2组和3组分离获得的单个核细胞各参数并无差别；经进一步纯化分离后，3组获得的单个核细胞中均为检测到中性粒细胞；2组在红细胞残留数和残留率方面明显低于1组和3组；3组在血小板残留总数方面并无差别，但1组和3组血小板残留率低于2组。因此，第2次分离单个核细胞采用1 800 r/min更为合适。

将上述所得到的单个核细胞进行冻存后，进行冻存前、后的细胞扩增培养及细胞表型分析，借以了解在实验室的条件之下所得到的免疫细胞质量。在冻存后1个月、6个月及12个月后培养PBMC细胞2周后的细胞数量(图3)及表型分析(图4)。起始培养数量为1×107个细胞，分别在细胞培养6 d及15 d后进行细胞计数(图3)。发现在未冻存时PBMC培养15 d后细胞总数量约可增加100倍左右。在冻存后1个月、6个月与12个月的数据分析显示虽然冻存后的细胞增值率略低，但冻存的时间增加并不影响后续细胞培养的增值率。

图3 单核细胞在冻存不同时间，复苏培养后所增加数量

在冻存后1个月、6个月及12个月后进行PBMC细胞培养2周后的细胞表型分析(图4)。在细胞培养15 d后进行细胞表型分析。结果显示冻存的时间并不影响培养后的细胞表型，甚至功能性T细胞(毒杀性T细胞及细胞因子激活杀手细胞)有些许增加的现象。在冻存前PBMC经培养后产生的毒杀性T细胞(CD3+CD8+)为60%左右，细胞因子激活杀手细胞(CD3+CD16+CD56+)约在17%左右。但随着冻存时间增加，PBMC冻存一年后培养所产生的毒杀性T细胞(CD3+CD8+)增为80%左右。此现象或许是因为在总细胞量减少的同时，针对性培养的细胞反而有更大的增值空间所致，这部分需要进一步的研究证实。

图4 单核细胞在冻存不同时间，复苏培养后的细胞分型

3 结论

为探索从健康献血中分离PBMC的最优离心参数，验证第1次和第2次处理时，采用不同离心力对PBMC分离的效果。得到的结论是:

1)第1次离心，在4 ℃条件下，2 800 r/min离心10 min分层离心所获得的白细胞效果最好。随后，经Ficoll密度梯度离心法分离白膜血中的PBMC，结果表明，第2次分离PBMC采用1 800 r/min离心20 min分离效果较好。

2)细胞冻存后的结果显示冻存时间增加并不影响后续细胞培养结果，反而有助于功能性T细胞的增殖。

4 讨论

目前，细胞免疫治疗在国内外越来越受到各大制药公司、科研机构的重视，如美国FDA于2017年批准了首个CAR-T免疫细胞产品的上市，这标志着全球采用免疫细胞治疗癌症时代的开启，个体化免疫细胞储存也随之越来越受到市场青睐[5]。

目前无论是已上市或是尚在临床试验阶段的免疫细胞制剂都是以自体来源的免疫细胞来操作。自体来源免疫细胞治疗与免疫细胞储存通常采用单采血细胞机采集[6]，或者直接抽取外周全血100～200 mL。单采方法需要多次循环采集全身血液中的免疫细胞，采集量较大，较多重症或者年老体弱者无法耐受。直接采集外周血的方法所获得的免疫细胞数量较少，可能仅满足一次培养所需免疫细胞。因此，两种采集方法均存在一定的限制。对于紧急需要治疗以及本身免疫细胞在质量上或数量上达不到操作标准的患者就会面临无细胞可用的困境。因此，如果可以事先进行培养扩增，对于这些患者来说会是一大益处。

为达到此目标，只能使用异体来源的免疫细胞。如器官移植，要使用异体来源必须经由组织相容性配型，而为了提高覆盖率，就必须要有大量的血液资源并从中提取出免疫细胞。

不同于自体来源，异体来源免疫细胞则另辟蹊径，收集血站常规富集成分血后废弃的白细胞(称为白膜血)，以此作为免疫细胞培养的种子细胞来源，可在配型成功后，满足大量免疫细胞培养的需要。因大量收集健康者来源的免疫细胞为首要条件，而能大量收集血液的唯一方法只有无偿献血，并从血袋内提取出单核细胞。如此，就有必要对如何能有效地从血袋内分离出单核细胞作为日后治疗所使用的种子细胞进行探讨。

为探索从健康献血中分离PBMC的最优离心参数，比较第1次和第2次处理，采用不同离心力时，哪一种对PBMC分离的效果最佳。首先，通过不同的离心转速，确定献血血袋分离白膜血的最佳离心参数,以结论所建议的方法，在各细胞分层后，PBMC层较厚、分布较均匀，洗涤细胞后管底细胞沉淀中红细胞较少, PBMC背景中混杂细胞，如红细胞、血小板及其他细胞碎片也少。此外，根据实验发现，分离的PBMC质量好坏还与外周血的铺层手法有一定关系，血液与Ficoll层面越清晰，稀释血冲破Ficoll层面程度越小，其分离后分离效果越佳。在相同淋巴细胞分离液条件下，进行血液铺层再二次分离PBMC，分离后所得根据PBMC厚度、分层状态、活力和得率结果进行对比，铺层分界面越清晰, 减少血液滴加的冲击力，减少Ficoll界面破坏程度，降低血液扩散的情形，不仅所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较少外，而且PBMC细胞得率及活力也较好。

PBMC除了可以培养出极专一性的CAR-T 细胞、TCR-T细胞和CAR-NK细胞[7]之外，常见的还有单核巨噬细胞[8]、记忆型毒杀免疫细胞，如CIK (细胞因子激活杀手细胞)、特异性T细胞[9]以及广谱型免疫细胞-NK细胞。这些都是由PBMC经培育之后大量增殖的免疫细胞，因此如何一次性取得大量的PBMC显得尤其重要。以适用性来说，CIK (细胞因子激活杀手细胞)与特异性T细胞的特点为具有对整个病原体的专一性而非单一抗原,对付疾病上更有效。毒杀型T细胞是个体遭遇病源后所产生的记忆免疫细胞，经培育放大后会针对相同病源起强烈的毒杀反应[10]。在实际医疗应用方面，对于像CMV、EBV等这些高危险伺机性且被感染者众多的病源，这些免疫细胞可以自体使用或异体经配型后使用，对于免疫低下的人群如器官移植患者、免疫功能不全及幼儿具有良好的免疫保护作用[11-12]。

本研究证实经第1次初步离心、第2次淋巴细胞分离液分离，该方法是一种简便、快速获得大量有活力的PBMC的方法。取得细胞的过程不因多次分离而造成细胞死亡，且保有其生物活性。为达到最佳实验结果，在实验中还需注意以下几方面：

1)采集新鲜人外周血于采血袋中，应同时避免高温、温度过低、大力度挤压和震荡导致溶血。

2)血液采集后要留取足够时间使白细胞聚集，一般需30 min以上。

3)血液装入离心缸，要求血袋平整，勿褶皱，褶皱多易使白细胞贴壁增多，从而导致分离获得的白细胞减少。

4)离心完毕，血袋从离心缸移至分浆夹过程中，勿使血液摇动，以免白膜层搅动，致白细胞获得量减少。

5)血袋夹入分浆夹后，轻轻松紧分浆夹，使白膜层上下轻微位移，减少细胞贴壁，增加白细胞分出量。

6)夹紧分浆夹，白膜层上移至血袋顶端2 cm处时，一手从一侧平推白膜层至中间出浆管口，另一手迅速从另一侧平推白膜层至出浆口。大量实践证实，分白膜两侧前后平推挤白膜比双侧同时挤白膜效果好：白细胞数量多，损失红细胞少。

此外，稀释血应缓慢加至淋巴细胞分离液层面上，并注意保持界面清晰 (淋巴细胞分离液事先浸润管壁)；吸取PBMC层时要避免过多吸取，否则会吸出其他的混杂细胞；在离心机中离心时，速度要慢升慢降，上升速度和下降速度都不宜过快，过快会导致淋巴细胞滤过Ficoll层导致获得量下降。