FNA样本BRAF V600E基因突变检测对甲状腺结节定性诊断的应用价值

姜燕平 荀延萍 傅佳仪

超声引导下进行细针穿刺细胞学检查（fine needle aspiration，FNA），为当前鉴别甲状腺结节最常用手段，具有准确性高、微创以及易操作等优点，但依然存在10%～40%的甲状腺结节难以经FNA 明确诊断[1]。BRAF V600E基因突变为目前报道最多的一种甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）突变类型。以往研究指出，BRAF V600E基因突变检测能够辅助细胞学诊断[2]。本文以98 个甲状腺结节FNA样本为实验对象，探讨甲状腺结节FNA样本检测BRAF V600E基因突变在良恶性定性诊断中的应用价值，以期为提高甲状腺结节诊断准确性提供有效途径应用依据。现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2015 年1 月—2020 年2 月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院接受FNC检测的甲状腺结节患者98 例，其中男29 例，女69例，年龄25～72（46.83±8.65）岁，结节直径0.7～2.6（1.09±0.20）cm。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）单个结节；（2）有FNA 指征[3]：①经过超声检查发现可疑恶性征象：病灶形态不规则，且其纵横比值超过1，边界显示不清，中央型血流，呈现极低回声以及微钙化；②病灶最大径超过0.5cm；③未合并全身器质性疾病或者出血性疾病等；（3）资料完整；（4）对研究知情，签署研究知情同意书。排除标准：（1）合并精神疾病；（2）伴凝血功能障碍；（3）具有其他肿瘤病史；（4）合并严重冠心病、高血压或者糖尿病等。

2 方 法

2.1 FNA 检查方法 FNA 前采取常规超声检查方式确定目标；对于手术治疗者，予以常规病理检查。

超声引导下FNA：指导患者处于仰卧位（穿刺体位），适当垫高颈部，保持头适当后仰，充分暴露颈部，常规探查甲状腺结节部位并定位于颈部体表，常规消毒、铺巾后，采取常规超声技术确定进针部位、具体角度与深度。手握探头的同时，适当固定加压，且以另一手持针进针，注意穿刺路线与超声探头表面长轴之间30°～40°。顺利进入目标后，在超声引导下用穿刺针分3 次穿入肿块内，并做到快速拔针，取出血性液体少许，仔细把针内容物推至相应玻片上涂片，并将其快速固定好，肉眼观察，判断所取标本是否足够，确认无误后予以细胞学病理检测。

细胞学病理诊断结果包括：（1）穿刺样本量较少；（2）考虑属于良性病变；（3）无法明确意义的病变；（4）诊断为嗜酸性肿瘤病变或滤泡性肿瘤病变；（5）可疑恶性肿瘤病变；（6）恶性肿瘤病变。其中（1）～（4）评估为细胞学阴性，（5）～（6）评估为细胞学阳性。BRAF V600E基因突变检测：选择福建厦门艾德人类BRAF基因V600E 突变检测试剂盒，采用荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法。引物序列如下：正义引物序列为5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3'；反义引物序列为5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'，引物序列的设计、合成由上海生工生物工程技术服务有限公司负责。DNA抽提采用福建厦门艾德核酸提取试剂盒（型号：FFPE DNA)，进行PCR 扩增后，可以将检测结果分为两种：野生型（未发现扩增信号，见图1）以及突变型（发现扩增信号，见图2）。

图1 野生型样本扩增曲线图

图2 突变型样本扩增曲线图

2.2 观察指标 以明确细胞学检查结果或常规病理诊断为“金标准”，观察BRAF V600E基因突变检测鉴别甲状腺结节良恶性敏感度、特异度及准确性。敏感度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%；准确性=（真阳性例数+真阴性例数）/总例数×100%；阳性预测值=真阳性例数/检出的总阳性例数×100%；阴性预测值=真阴性例数/检出的总阴性例数×100%。观察常规病理学诊断情况，分析BRAF V600E基因突变与PTC 临床特征关系。

2.3 统计学方法 应用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计数资料以（%）表示，使用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义；采用Kappa 检验法进行一致性分析，中等一致性：Kappa 值范围为0.41～0.60，高度一致性：Kappa 值范围为0.61～0.80，几乎完全一致：Kappa值超过0.80。

3 结果

3.1 细胞学检查与常规病理结果 明确细胞学检查结果或常规病理诊断显示78 个PTC，20 个良性结节89.74%（70/78）；PTC 显示BRAF V600E基因突变型10.26%（8/78），显示野生型。

3.2 BRAF V600E基因突变检测与金标准对照结果BRAF V600E基因突变检测诊断敏感度89.74%（70/78），特异度100.00%（20/20），准确性91.84%（90/98），阳性预测值100.00%（70/70），阴性预测值71.43%（20/28），Kappa 值0.78。见表1。

表1 BRAF V600E基因突变检测与金标准对照（例）

3.3 常规病理学诊断分析 细胞学病理检查无法明确结节8 个，经过手术常规病理检查，证实为4 例PTC（其中1 例为野生型，3 例突变型）与4 例良性结节（均为野生型）。

3.4 BRAF V600E基因突变与PTC 临床特征关系38 例PTC 予以手术治疗，并行常规病理检查（均显示PTC），其中30 例为BRAF V600E基因突变型，8 例野生型。突变型与野生型PTC 患者性别、年龄、甲状腺包膜侵犯率、中央区淋巴结转移率、桥本甲状腺炎发生率、肿瘤最大径比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 BRAF V600E基因突变与PTC 临床特征关系

4 讨论

FNA 诊断范围受到细胞学形态限制，无法全面了解病变类型，故其检查结果依然存在一定不确定性。对于某些细胞学无法确诊甲状腺结节，一般恶性可能性为5%～10%，甚至可达50%～75%[4]。

研究表明，甲状腺癌BRAF基因相关突变位点里面，BRAF V600E 位点发生突变为当前最常见的一种变异表达形式，在各种BRAF 突变中，其比例高达95%[5]。BRAF V600E基因突变主要出现于经典型PTC，在滤泡癌以及髓样癌中较为罕见，且在甲状腺良性结节检测中未发现这种突变，故临床普遍PTC最常见，具有较高特异性的一种基因异常为BRAF基因突变[6-7]。文献报道，甲状腺结节FNA样本测定患者BRAF V600E基因突变情况，是术前PTC 特异性非常高的诊断手段[8]。本研究结果显示，BRAF V600E基因突变检测方式诊断甲状腺结节良恶性敏感度89.74%，特异度100.00%，准确性91.84%，Kappa 值高达0.78，与上述报道观点相符。说明BRAF V600E基因突变检测具有较高诊断准确性，与病理诊断几乎完全一致。对于FNA 中病理意义不明确甲状腺结节，若经BRAF V600E基因检测显示为突变型，则更益于PTC 诊断[9]。当前，以BRAF V600E基因突变情况和PTC 侵袭性关系为主要研究内容的报道结果争议较大。相关研究表明，BRAF V600E基因突变可预测PTC 存在侵袭性，包括肿瘤更高分期、出现淋巴结转移以及包膜侵犯等[10]。然而，亦有研究显示，BRAF V600E基因突变的发生和PTC 侵袭性之间没有显著相关性[11]。相关研究指出，相较于BRAF V600E基因野生型PTC，突变型PTC 患者甲状腺包膜侵犯出现率更高，但是在颈部淋巴结转移率方面不存在显著差异[12]。本研究中，突变型与野生型PTC 患者甲状腺包膜侵犯率、中央区淋巴结转移率以及桥本甲状腺炎发生率比较无显著差异，BRAF V600E基因突变检测并不能预测PTC 患者甲状腺包膜侵犯以及中央区淋巴结转移情况，与上述报道结果并不完全一致。可能与本次研究样本量较少，具有一定局限性有关。

综上所述，FNA样本检测BRAF V600E基因突变对于诊断甲状腺结节良恶性具有重要价值，然而其不能预测PTC 甲状腺包膜侵犯或者中央区淋巴结转移情况。