湖州地区献血人群隐匿性乙型肝炎病毒感染的血清学特征及分子机制研究

莫艳萍 施旭斌 费静娴 杨海英

全球约有3 亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），我国为HBV 高流行区，HBV 感染率约占33%[1]。虽随乙肝疫苗接种的普及，HBV 母婴传播减少，人群乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）携带率降低，但一般人群HBsAg 阳性率仍高达7.1%[2]。以往常将血清HBsAg 阳性作为判定是否感染HBV 的依据。自首例报道HBsAg 阴性供血者血液引起HBV 感染以来，血清HBsAg 转阴代表HBV 清除的观点受到质疑。后续较多报道均提出隐匿性HBV 感染（Occult HBV infection，OBI）现象存在，且OBI 被认为是导致输血传播HBV 的关键原因，此类患者除血清转换前的窗口期外，机体均存在HBV DNA，但HBsAg 无法检出感染，常表现为阴性，乙型肝炎核心抗体（hepatitis B core antibody，抗-HBc）呈阳性或阴性[3-4]。研究发现，OBI 与献血者HBV 再激活及受血者输血感染HBV 有关，献血人员隐匿性HBV 感染可能为HBV 传播潜在传染源[5]。调查发现，OBI 在不同地区、不同人群中流行存在区别，病毒基因型分布存在地域特点[6]。发生OBI 分子学机制可能与小S基因变异有关[7]。本研究分析浙江省湖州地区献血人群OBI 数据，以了解当地无偿献血人群中OBI 血清学特点及分子生物学特征，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2018 年1 月—2019 年9 月浙江省湖州市中心血站无偿献血者献血标本，均符合献血者健康检查要求（GB18467-2011）中相关规定[8]。全部样本经HBsAg 与丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）初筛合格后，采集肘静脉血标本7mL，抗凝后保存。OBI 确认标准：HBsAg 阴性，核酸检测（NAT）阳性，补充鉴别试验HBsAg 阴性，HBV-DNA 阳性；血液标本乙肝表面标志物1 种或多种跟踪、回溯时无明显改变；乙肝血清表面标志物全阴，追踪回溯仍全阴[9]。共获得30 份HBsAg 阴性而NAT 阳性标本，作为OBI 组。并收集30 份HBsAg初、复检均阳性而NAT 阳性标本作为阳性对照组。

1.2 主要试剂与仪器 HBsAg 诊断试剂盒[酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），初筛：上海科华生物工程股份有限公司（2016716），复筛：美国雅培公司（YS02190B）]，乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）、乙型肝炎e 抗原（hepatitis B E antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗体（hepatitis B E antibody，抗-HBe）、抗-HBc 检测试剂盒[初筛：电化学发光法，瑞士罗氏公司（182213、150464、044258、179963）；复筛：ELISA 法，美国雅培公司（J05475、J04829、J05675、J12475）]，ALT 检测试剂盒[初筛：上海科华生物工程股份有限公司（150494），复筛：澳斯邦生物工程有限公司（J26471）]，HBV 病毒DNA 提取试剂盒（购自瑞士罗氏公司，K00918），HBV 病毒载量定量测定试剂盒（购自大连宝生物工程有限公司，152513），TaKaRa Taq/TaKaRa LA Taq（均购自大连宝生生物工程有限公司），Expand High Fidelity PCR system（瑞士罗氏公司），病毒核酸扩增检测（nucleic acid amplification test，NAT）筛查试剂盒[初筛：上海浩源生物科技有限公司（181365）；复筛：瑞士罗氏公司（K00918）]；诺华TIGRIS 全自动NAT 仪（购自美国诺华公司），Xantus-200型全自动加样仪（购自瑞士Sias 公司），Microlab FAME 全自动酶免分析系统（购自瑞士Hamilton 公司），cobas e411型电化学发光检测仪（购自美国罗氏公司），ABI 9700型巢式（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪（购自德国ABI 公司），电泳仪（北京六一仪器厂）；引物设计及合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 方 法

1.3.1 血清学检测 全部血样均由浙江省湖州市中心血站收集，采用ELISA 法进行HBsAg 检测，所有血样均采用国产与进口双试剂初筛与复筛，所有血源性筛查试剂盒均为国家制定权威机构批检合格，严格按试剂盒使用说明操作，判读结果。采用化学发光法检测抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc，抗-HBc复筛采用ELISA 法，初筛、复筛结果均阳性判定为抗-HBc 阳性。

1.3.2 NAT 检测 排除血清学检查不合格样本，采用诺华TIGRIS 全自动NAT 检测系统对献血者标本进行三联荧光病毒单人份NAT 检测，对ELISA 阴性但NAT 阳性的反应性标本补充做核酸鉴别试验，鉴别试验结果为HBV DNA 阳性，最终判定为HBsAg阴性，HBV DNA 阳性。

1.3.3 HBV 病毒提取及定量检测 参照HBV基因提取试剂盒提取OBI样本HBV DNA 核酸，取200μL HBsAg 阴性/HBV DNA 阳性标本，并选择HBsAg 阳性、HBV DNA 双阳性标本作为阳性对照，提取450μL DNA 抽提液+4μL 内标溶液自离心管内，HBV 质控样品购自北京康彻思坦生物技术有限公司，振荡混匀，瞬时离心，100℃温浴10min，冷却5min，13800g 离心5min，取上清液20μL 加入PCR反应孔，上PCR 仪进行HBV-DNA 定量分析，反应体系：模板DNA 5μL+上下游引物各1.5μL+DNA Mix 12.5μL+探针0.4μL+双蒸水补足至25μL，PCR扩增反应条件：95℃ 10min，95℃ 30s，55℃ 60s，42个循环。

1.3.4 HBV S 区基因扩增与测序 preSS 区基因半巢式PCR 扩增，未扩增成功样本继续行S 区巢式PCR 扩增（引物见表1），preSS 区扩增体系（第1轮）：LA 10×Buffer 2μL+dNTP 0.8μL+上下游引物各0.4μL+LA Taq 0.2μL+超纯水11.2μL+模板5μL，反应条件：94℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃3min，34 个循环，72℃10min。第2 轮反应体系：LA 10×Buffer 2μL+dNTP 0.8μL+上下游引物各0.4 μL+LA Taq 0.2μL+超纯水14.2μL+模板2μL，反应条件：94℃ 4min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 3min，24 个循环，72℃10min。S 区扩增体系（第1 轮）：10×NH4 Buffer 2μL+50mM MgCl2 1μL+dNTP 0.25μL+上下游引物各2μL+BioTaq 0.5μL+超纯水2.25μL+模板10μL，反应体系（第1 轮）：10×NH4 Buffer 2μL+50mM MgCl2 1μL+dNTP 0.25μL+上下游引物各2μL+BioTaq 0.25μL+超纯水7.5μL+模板5μL，反应条 件：95℃ 2min，94℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 45s，38个循环，72℃10min，扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳，阳性条带切胶回收，回收产物送检测序。

表1 引物序列

1.3.5 OBI样品基因分型 登录NCBI 网站genotyping 页面对测序获得序列进行HBV基因分型，采用MEGA 5.2 软件对OBI 组与阳性对照组核苷酸、氨基酸序列进行比对。

1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件分析数据，计量数据用均数±标准差（±s）表示，组间t 检验，多组比较方差分析，计数数据率（%）表示，组间率比较采用χ2检验或Fisher 确切概率分析，双侧P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 湖州市无偿献血标本OBI 检出情况、一般资料及血清学特点 2018 年1 月—2019 年9 月浙江省湖州市中心血站共采集无偿献血标本109560 份，其中HBsAg 初、复筛均阴性而NAT 阳性标本共检出30 份，检出率为0.027%（30/109560）。OBI 血清学模式：抗-HBc（+）/抗-HBs（-）12 例（40.00%），抗-HBs（+）/抗-HBc（+）8 例（26.67%），抗-HBs（+）/抗-HBc（-）3 例（10.00%），抗-HBc（-）/抗-HBs（-）7 例（23.33%），不同血清学模式OBI 患者年龄、性别、ALT、献血次数等资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 浙江省湖州市OBI 无偿献血者一般资料与血清学特点

2.2 湖州市无偿献血者OBI 血样本血清学特点30 份OBI 标本HBV-DNA 病毒载量区间为8～1751（中位数268.33）IU/mL，ALT 范围为10～36（中位数18.13）U/L，见表3。

表3 浙江省湖州市无偿献血者OBI 血样本血清学筛查结果

2.3 湖州市无偿献血者OBI 血样本分子生物学检测结果 30 份OBI 无偿献血样本中29 份（96.67%）标本S 区扩增成功，2 份（6.67%）全基因型扩增成功，23 份（76.67%）BCP/PC 扩增成功，S 区、BCP/PC两个片段均扩增成功22 份（73.33%）；基因型分型：B型23 例（76.67%），C型5 例（16.67%），未明确分型2例（6.67%）；血清型：adw 共24 例（80.00%），adr 共5例（16.67%），ayr 共1 例（3.33%），见表4。

表4 浙江省湖州市OBI 无偿献血者样本分子生物学检测结果

2.4 OBI 组与阳性对照组HBV基因型分布比较OBI 组与阳性对照组HBV基因型均以B基因型占优势，两组基因型分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表5 OBI 组与阳性对照组HBV基因型分布比较[例（%）]

2.5 OBI 组与阳性对照组S 区序列结果比较 采用MEGA 5.2 软件将获得OBI 组获得序列与阳性对照组序列进行同源性比对，序列范围为NT241～685，片段长度445bp，翻译为氨基酸序列33～177AA，两组小S 区基因HBsAg 主要亲水结构域氨基酸突变情况（见表6）。OBI 组29 例扩增、测序成功，小S 区18例（62.07%）均伴不同程度氨基酸突变，2 例（6.90%）OBI 提前形成终止密码子；阳性对照组小S区10 例（33.33%）出现氨基酸突变，变异位点与OBI不相同，1 例（3.33%）提前形成终止密码子，OBI 组S区突变率高于阳性对照组（χ2=4.883，P=0.027）。

表6 OBI 组与阳性对照组S 区序列结果对比[例（%）]

3 讨论

国内相关统计报道，无偿献血人员OBI 发生率为0.7%～10.6%[10]。本文共收集浙江省湖州市中心血站无偿献血标本109560 份，OBI 检出30 份，检出率为0.027%，较上述统计结果偏低，考虑可能与地域差别及OBI 界定区别有关，上述调查HBsAg 检测均使用国产试剂盒，可能出现HBsAg 假阴性结果。且可能仅检测HBV 病毒X 区基因组，导致假阳性率增加。而本研究中均使用两种试剂盒对HBV 感染情况进行初筛、复筛，可减少假阳性出现可能，并通过ELISA 法、化学发光法检测血清标志物，可提高HBsAg 检测敏感度与特异度。

前期研究发现，血清学模式中抗-HBc 阳性患者有更高的OBI 检出率，尤其单独抗-HBc 阳性者[11]。本次调查显示，湖州市中心血站检出30 份隐匿性HBV 感染血标本中抗-HBc（+）/抗-HBs（-）12 例，占40.00%，抗-HBs（+）/抗-HBc（+）8 例，占26.67%，其ALT 均处于正常范围，HBV-DNA 病毒载量较低，支撑上述研究结果，说明抗-HBc 阳性献血者HBV 隐匿性感染风险较高，常呈现ALT 正常，HBV-DNA 病毒载量较低的特点。但本研究此项结果与Zhang 等[7]报道的HBV 低流行地区OBI 抗-HBc 阳性率较低的结论存在差别，可能与不同地域HBV 流行性特点存在区别有关，但仍提示抗-HBc 阳性献血者体内HBV DNA 存在风险较大，需引起重视。且本研究发现，不同血清组OBI 患者年龄、性别、ALT、HBVDNA 病毒载量及献血情况等资料均无明显差别，考虑可能与本组OBI 献血前均已完成ALT、HBsAg 初步筛查有关。在基因型分布方面，本研究OBI 组主要以B型为主，与阳性对照组基因型分布类似，支撑叶贤林等[12]研究提出南方地区HBV基因型主要为B型的结论。血清学分型方面，OBI 均以adw型为主，ayr 相对少见，与吕莹等[13]调查结果一致。

目前对OBI 发生的机制尚未完全阐明。有研究认为，S 区基因突变所致氨基酸变异与OBI 发生密切相关[14]。本研究发现，OBI 组S 区基因变异所引起氨基酸改变共18 例，占62.07%，高于阳性对照组，支持上述结果。说明OBI 发生与HBV DNA S 区基因位点突变有关。S 蛋白含2 个亲水区，系HBsAg 重要表面抗原位点，引起保护性免疫反应的作用。该基因第二个亲水区含HBsAg 抗原决定簇“α”决定簇基因，同时也是乙肝疫苗关键保护性表位及乙肝免疫球蛋白关键靶点，对维持HBsAg 抗原性有重要作用，影响乙肝疫苗、乙肝免疫球蛋白药效及效力，可保护机体免受病毒感染[15]。单个或多个氨基酸变异均可改变其抗原性，导致氨基酸突变，HBV 野毒株无法产生中和性抗体，造成HBsAg 亚型改变，引起OBI。此类患者变异后，HBsAg 血清浓度低或抗原性改变，通常难以检出，导致机体单纯呈抗-HBs 阳性或抗-HBc 和抗-HBs 同时阳性。

近年研究显示，OBI 亲水区存在较多典型突变位点，包括G145R、P120T、G119R 等[16]。其中G145R为常见突变位点，与S 区变异所致免疫逃逸有密切关联，直接影响HBsAg 免疫测试试剂反应性。本研究发现，OBI 组S 区变异中G145R 出现频率较高，支持以上结论，说明此位点突变可能对HBsAg 试剂检测能力产生影响，导致HBsAg 阴性结果，影响HBV感染判断。此外，本研究也显示，无偿献血人群OBI存在多个常见突变位点，包括P105R、S114A、S31N、1150F 等，考虑上述位点氨基酸改变可造成HBsAg活性变化，影响HBV 病毒复制、分泌，干扰HBV 感染能力，说明OBI 发生的机制可能与多基因综合改变有关。

综上所述，浙江省湖州市献血人员中OBI 检出率为0.027%，抗-HBc 阳性患者OBI 感染率较高，HBV基因型分布以B型为主；HBV S 区基因变异，尤其是HBsAg“α”决定簇氨基酸改变可能为OBI 感染的重要分子学机制，可作为OBI 分子研究的新方向。同时还需注意由于OBI 的存在对输血安全造成较大隐患，因此，有必要将ELISA 法、NAT 检测引入血液筛检体系，以确保输血安全。但由于本研究所收集OBI 病例数较少，后续将收集更多样本以进一步补充完善该结论。