COPD患者肺泡灌洗液中免疫球蛋白、淋巴细胞亚群及iNOS的表达及相关性

陈秀兰

福建省老年医院呼吸与危重症医学科,福建省福州市 350001

慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种严重威胁全球公众健康的慢性呼吸道疾病，尤其是老年患者，以不完全可逆的气流受限为特征，已证实病情的发展与抽烟、环境污染、感染等存在明显关系，由于异常炎症反应的持续存在，进行性的削弱机体免疫功能，包括体液免疫和细胞免疫[1]。目前，对不同GOLD分组的COPD患者肺泡灌洗液中免疫球蛋白、淋巴细胞亚群、诱导型一氧化氮合成酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)的相关性研究尚少。本文以不同分组COPD患者作为研究对象，检测其Ig、淋巴细胞亚群、iNOS的水平，并探讨各组免疫状态及与iNOS相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 160例COPD患者均为我院住院或门诊的患者，均符合慢性阻塞性肺病诊断标准《慢性阻塞性肺疾病基层诊疗指南(2018年)》[2]。所有COPD患者以肺功能水平(第1秒呼气容积占预计值的百分比FEV1%pred)进行分组。其中，A组为FEV1pred≥80%；B组为50%≤FEV1pred<80%；C组为30%≤FEV1pred<50%；D组为FEV1pred<30%。A组40例，男25例，女15例，平均年龄(66.67±11.34)岁；B组40例，男24例，女16例，平均年龄(69.58±12.19)岁；C组40例，男26例，女14例，平均年龄(69.54±11.26)岁；D组40例，男22例，女18例，平均年龄(71.21±13.41)岁；选取同期健康者40例作为对照组，男20例，女20例，平均年龄(66.74±10.26)岁。比较五组研究对象一般资料，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，且所有研究对象均经过我院伦理委员会要求，同时签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫比浊法：免疫球蛋白试剂(德国罗氏公司)，采用日立全自动生化分析仪检测各组肺泡灌洗液中IgA、IgG、IgM的表达。

1.2.2 淋巴细胞亚群检测：流式细胞仪分析CD4+、CD8+T、B和NK淋巴细胞亚群(Beckman Navios型号)，八色荧光抗体试剂(Beckman公司提供)。

1.2.3 RT-PCR检测iNOS mRNA的表达：每组取1ml的肺泡灌洗液悬液，加入200μl的Trizol裂解液中，先提取总RNA，并按照逆转录试剂说明书逆转录为cDNA，iNOS和β-actin引物序列，见表1。扩增PCR反应体系，反应条件：94℃预变性90s；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；最后72℃延伸5min。每份标本3个复孔，复孔间Ct值差异<0.5，以β-actin为内参，Ct值减去内参的Ct值作为△Ct，用2-△△Ct表示目的基因的表达量。

表1 依据GenBank序列设计引物

1.2.4 ELISA法检测NO和IL-6水平：收集各组患者肺泡灌洗液，酶联免疫吸附试验检测NO和IL-6表达水平，严格按说明书操作。

2 结果

2.1 免疫球蛋白水平 四组COPD患者中IgM、IgA水平测定水平与对照组比较无明显差异，两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。除A组外，B组、C组、D组患者IgG的检测水平均高于对照组，比较差异具有统计学意义(t=9.436、11.754、13.421，P<0.05)，见表2。

表2 各组COPD患者IgM、IgA和IgG水平比较

2.2 淋巴细胞亚群水平 四组CD4+T细胞计数和CD4+T/CD8+T比值均显著低于对照组，随着分组级别越高，显著性更明显，差异具统计学意义(P<0.05)。四组患者CD8+T计数水平较对照组明显升高，二者比较差异具有统计学意义(t=9.258、11.631、14.135、12.962，P<0.05)。B组、C组、D组与对照组、A组CD3-CD19+比较明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。B组、C组、D组与A组、对照组NK细胞比较均明显下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表3、表4。

表3 各组T淋巴细胞亚群水平比较

表4 各组B和NK淋巴细胞亚群水平比较个/μl)

2.3 iNOS、NO和IL-6水平 除A组外，其他三组iNOS水平均较对照组明显升高，且进行性升高，两两比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。B组、C组、D组的NO和 IL-6水平与对照组比较明显升高，两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表5。

表5 各组iNOS、NO和IL-6水平比较

2.4 iNOS与IgG、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T、NK细胞水平的相关性 采用Spearman分析相关性，发现所有COPD患者的iNOS与CD4+T、CD4+T/CD8+T、NK细胞水平呈负相关关系(相关指数r=-0.576，P<0.001；r=-0.443，P=0.019；r=-0.364，P=0.043)；iNOS与CD8+T、IgG水平存在一定正相关关系(相关指数r=0.512，P<0.001；r=0.401，P<0.001)；iNOS与B淋巴细胞水平无明显相关性(相关指数r=0.102，P>0.05)。

3 讨论

COPD是一种慢性气道炎症性疾病，但并不仅局限于气道，对全身的各个系统影响也不容忽视，尤其是机体免疫系统，长期的慢性炎症刺激，各种淋巴细胞功能均有相应的变化，其中以CD4+T淋巴细胞减少为特征，常并发严重感染[3]。人体内辅助性T细胞破坏，细胞免疫功能下降，并继发体液免疫功能下降，随即出现免疫球蛋白含量异常变化，参与机体的体液免疫调节，在机体抵抗病原体感染过程中的起重要作用[4]。T淋巴细胞具有多种生物功能细胞亚群，包括有CD4+T、CD8+T等，其中CD4+T细胞既可促进细胞免疫，又可分泌促炎性因子，可分为Th1、Th2、Th3等，主要分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ及IFN-α等，参与介导细胞毒活性，增强吞噬细胞、NK细胞功能，调节局部炎症免疫应答，促进细胞免疫和辅助抗体生成。CD4+T细胞还可分泌IL-4、IL-5等，刺激B淋巴细胞增殖，参与体液免疫应答，生成大量免疫球蛋白如IgG、IgA等，协同细胞免疫，发挥抗体的潜力，保护机体免受感染[5-7]。CD4+T细胞能促进其他T细胞的分化成熟，也可参与体液协助B细胞产生Ig，是机体重要的免疫调节细胞。本研究通过检测各组肺泡灌洗液中免疫球蛋白、淋巴细胞、iNOS的表达，结果发现随着临床分组级别越高CD4+T细胞下降越明显，且与iNOS水平呈负相关[8-9]。iNOS分布于多种细胞中，如：巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、角质化细胞和血管平滑肌细胞等，可产生大量NO，促进组织和细胞损伤，可刺激机体产生NO、IL-6等下游炎症介质。本研究结果显示iNOS表达与CD8+T水平存在一定正相关关系，早期监测CD8+T基线水平可提前预知患者炎症水平高低，可作为治疗期间评估指标[10-12]。本文对COPD不同阶段Ig分析，A组患者炎症水平尚不活跃，相对静止状态，IgG表达水平尚未被完全激发，随着COPD级别升高，可因疾病严重程度而刺激性增加。相关性分析发现COPD患者Ig与iNOS水平水平存在一定正相关，说明体液免疫起着关键的作用。与对照组相比，COPD患者的IgG显著升高，各种机会性感染概率上升，可反映COPD疾病发生的转归。笔者发现COPD患者四组中，IgA、IgM水平测定与健康对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，仍需进一步证实。

综上所述，不同阶段COPD患者的免疫功能因疾病分级存在差异，纵向比较发现Ig、淋巴细胞亚群与iNOS之间变化水平，提示CD4+T、Ig和iNOS在判断病情严重程度、评估炎症水平方面起着重要作用，可将iNOS及NO、IL-6等下游炎症因子作为评估炎症严重程度的预测指标。