谈生物试题中的PCR衍生技术高考考查要点

郭胜超

摘    要：PCR技术已被广泛应用于生物的很多领域，也是命制生物高考试题的重要素材来源。本文从高中生物试题的角度，分析介绍PCR衍生技术的原理、步骤和应用，旨在引导广大教师和学生关心和关注日新月异的生物科技发展，提高学生的生物学核心素养。

关键词：PCR;引物;扩增;考查载体

PCR是多聚酶链式反应（polymerase chain reaction）的缩写，该技术是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年发明的。现已被广泛应用于法医鉴定、环境监测、分子克隆、基因序列分析、考古学等重要领域。PCR技术促进了分子生物学、遗传学、生物化学等学科的发展，也是高考评价体系中考查载体的重要来源。目前PCR的衍生技术种类繁多（见表1），本文针对常见的PCR技术在命制高中生物试题中的应用进行了整理和分析。

例1  新冠疫情的快速控制，离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒（RNA病毒）的快速检测能力。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图1）。随着PCR的进行，荧光信号的强度也等比例增加，可通过荧光强度的变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图（如图2）。Ct值（循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是（C）

A.检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNA

B.PCR的每个循环包括变性、复性和延伸3个阶段

C.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性越高

D.图2出现平台期的最可能原因是反应体系中的引物、探针数量一定

1.逆转录PCR技术（RT-PCR）

新冠病毒属于RNA病毒，在例1的检测中涉及到逆转录PCR技术。其步骤如图3所示：（1）逆转录过程需要加入逆转录酶、引物P1和原料，将新冠病毒的RNA逆转录为cDNA。（2）再以cDNA为模板，利用引物P2合成目的基因片段。（3）利用引物P1和P2对目的片段进行PCR扩增。进行上述操作，选用的模板RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。

考查载体：逆转录PCR技术可用于获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统等，还可以用来分析不同组织细胞，或是相同组织细胞在不同发育阶段中mRNA表达情况。

2.熒光定量PCR（RTFQ-PCR）

例1中的荧光定量PCR技术是一种在DNA扩增反应中，利用荧光探针（荧光染料或荧光标记的特异性的DNA单链，它的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，如图2所示）对PCR产物进行标记跟踪，结合相应的软件可以对产物进行分析，推测待测样品浓度的方法。每扩增一次，就有一个荧光分子生成。根据题干信息可知，待检测样本中的病毒越多，每次消耗的荧光探针就越多，发出的荧光越强，达到设定荧光阈值所需的循环数就越小，即Ct值越小。在PCR过程中为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才能确诊。当PCR扩增到一定轮次，加入的探针或引物消耗殆尽，荧光强度将达到最大值，即出现图2中“平台期”。

考查载体：荧光定量PCR可用于人和动物疾病的诊断、食品中微生物的达标检测、分子生物学中的定量研究等领域。

例2（2020年江苏高考题节选）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例），请据图回答问题：

（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是②④（从引物①②③④中选择，填编号）。

3.反向PCR技术（Inverse PCR）

例2主要考查了反向PCR技术的应用。常规的PCR技术是直接扩增两引物之间的已知DNA片段，而该技术是利用扩增引物向相反方向扩增未知DNA序列（如图4），从而实现对未知序列进行分析和研究的目的。因此上述试题中要选择②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'和④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'作为引物。

在进行反向PCR技术时，先选择已知序列内部没有切点的限制性内切核酸酶对该段DNA进行酶切，然后用DNA连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再根据已知序列设计一对反向的引物进行PCR，最后扩增出已知序列上游和下游的未知序列。

考查载体：反向PCR技术还可用于已知序列的上、下游未知序列的测定，还可用来制备未知序列的探针。

例3大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图5所示。下列叙述正确的是（不定项选择）（BD ）

A.第一轮PCR过程中复性所用的温度与第二轮PCR复性的温度是一样的。

B.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，该定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译。

C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链。

D.将某功能蛋白的第17位Cys（UGU）改造成Ser（UCU），属于蛋白质工程。

4.编码基因的特异性定点突变

编码基因的特异性定点突变是指通过PCR等方法，插入、去除或替换个别核苷酸，最终获得突变的基因。定点突变技术的类型很多，例3中是借助大引物进行PCR定点突变，大致步骤是（如图6）：（1）先合成一段含突变核苷酸的DNA引物P1，并将其杂交到目的基因的DNA单链上，引物上的个别突变核苷酸不会影响其与DNA单链结合。（2）利用突变引物P1与侧翼引物P2，通过第一阶段的PCR扩增出如图所示的DNA分子。（3）利用第一阶段的PCR产物的单链作为引物，配合侧翼引物P3，通过第二阶段的PCR扩增出突变基因。精确设计引物是成功的关键，该方法操作简单，突变的成功率较高。

考查载体：编码基因的特异性定点突变常用于蛋白质工程，通过基因定点突变改变编码基因的碱基序列，最终实现对蛋白质分子中某活性部位的1个或几个氨基酸残基序列的改变。

5.融合PCR技术

PCR技术除了可以实现编码基因的特异性定点突变，还可以通过PCR的方法实现两个基因的融合，即融合PCR技术。以图7为例，要实现基因A和B的融合，需要先设计的P2引物含有基因B片段的一部分，P3引物含有基因A片段的一部分。通过PCR扩增就能分别得到含有B基因片段序列的A基因和含有A基因片段序列的B基因。然后分别取基因A、B的PCR产物单链搭连，互为引物，进行PCR扩增，得到融合基因A-B。最后加入引物P1和P4进行PCR，得到多个融合基因A-B的拷贝。

考查载体：随着技术的发展，融合PCR技术逐步应用于基因敲除、基因标记、基因内部点突变、两种基因融合等领域。

PCR的衍生技术还有很多，这里不再赘述。随着新课程改革的深入推进，高考试题的命制越来越体现时代性和创新性，紧密结合科学技术前沿理论和工程技术领域，综合考查学生的学科核心素养。建议教师多收集与教材知识联系密切的生物科技素材，简化整理后介绍给学生，培养学生快速获取相关的生物学信息和知识迁移的能力。

■ 编辑/魏继军