D3胚胎形态学评分对单囊胚冻融移植周期临床结局的影响

方璐，黄亚，徐杰，祁秀娟

(上海永远幸妇科医院生殖医学中心，上海 200131)

辅助生殖技术(ART)发展40年来，随着临床促排卵方案的优化和胚胎培养技术的提高，囊胚的移植成功率显著升高，但在 IVF-ET治疗过程中仅有50%～60%的胚胎被利用，这是由于一些D3胚胎因为胚胎评分低而被丢弃[1]。临床常常面临患者因无法获得优质D3胚胎而导致ART治疗失败的困扰。因此，如何合理利用已获胚胎，缩短治疗时间、提高累计妊娠率是生殖医生共同关注的问题。有研究发现，将非优质D3胚胎在体外进行囊胚培养，玻璃化冷冻复苏后再进行移植，尽管囊胚形成率较低，但仍有成功分娩健康婴儿的病例报道[2-3]。Stecher等[4]通过延时成像观察到一些质量较差的D3胚胎在培养成囊胚后移植可获得活产分娩。以上研究表明，即使评分低的D3胚胎在囊胚培养过程中仍有可能表现出较好的发育潜能。

本研究回顾性分析了2017年4月至2020年1月在本院生殖中心行冻融单囊胚移植的699个周期的临床资料，探讨不同评分的D3胚胎进行囊胚培养后再行单囊胚冻融胚胎移植的妊娠结局，旨在为胚胎培养和单囊胚胎移植提供临床依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2017年4月至2020年1月在本院生殖中心行冻融单囊胚移植患者的临床资料。

纳入标准：18 kg/m2≤体质量指数(BMI)≤30 kg/m2，行冻融单囊胚移植的患者。

排除标准：≥45岁；合并子宫畸形、严重子宫腺肌症或者伴有其它子宫器质性病变。

本研究共纳入699个移植周期。根据不同囊胚来源的D3胚胎形态学评分分为两组：D3胚胎为非优质胚胎者(D3非优胚组，n=492)；D3胚胎为优质胚胎者(D3优胚组，n=207)。

二、研究方法

1.促排卵方案：根据女方年龄和卵巢储备功能选择适当的促排卵方案，包括微刺激促排卵方案、高孕激素状态下促排卵方案(PPOS)、拮抗剂方案等。于扳机后35～37 h经阴道超声引导下穿刺取卵。授精方式以手术当天男方精液情况决定。

2.囊胚培养及评分：应用卵裂胚胎培养液(Sage，美国)和囊胚培养液(Kitazato，日本)进行序贯培养，将D3胚胎转移至囊胚培养，继续培养观察至第5、6、7天。

根据D3胚胎形态学标准[5]进行评分，分为Ⅰ级(7～9个细胞，卵裂球大小均匀，碎片<10%，无空泡)、Ⅱ级(6～10个细胞，卵裂球大小基本均匀，碎片10%～20%，无空泡)、Ⅲ级(>4个细胞，卵裂球大小不均匀或有少量空泡，碎片为20%～50%)和Ⅳ级(<4个细胞，卵裂球明显不均匀，有大量空泡，碎片>50%)。其中D3发育到6～10个细胞的Ⅰ、Ⅱ级胚胎定义为优质胚胎，D3发育为2～10个细胞的Ⅲ、Ⅳ级和>10个细胞Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胚胎定义为非优胚胎。

囊胚评分采用Gardner评分标准[6]，其中AA、AB、BA囊胚为优质囊胚；D5囊胚或D6囊胚直径≥16 mm或D7囊胚直径≥18 mm视为可冻存的囊胚。所有囊胚移植前均进行激光辅助孵化。

3.囊胚玻璃化冷冻和解冻：将囊胚放入玻璃化冷冻试剂盒(VTl01，Kitazato，日本)的平衡液(ES)中平衡8～15 min，然后将平衡后的囊胚移入玻璃化冷冻液(VS)中放置60～90 s，随后将囊胚迅速装入冷冻载杆放入液氮中。囊胚解冻时，将载杆上的胚胎转移到玻璃化解冻试剂盒(VTl02，Kitazato，日本)的解冻液(TS)中，37℃放置1 min，然后转移到稀释液(DS)中，25℃放置3 min，再转移到清洗液(WS)中放置5 min，清洗2次，最后将胚胎在培养基(Art-1029，Sage，美国)中清洗2次，立即用倒置显微镜(IX-73，Olympus，日本)观察胚胎解冻3 h后的扩张情况。

4.内膜准备方案：对于月经规律的患者采用自然周期准备内膜，排卵前注射HCG(珠海丽珠医药)5 000 U，监测到排卵后口服地屈孕酮片(达芙通，苏威制药，荷兰)10 mg，3次/d，5 d后进行囊胚移植。对于无规律月经周期的患者采用激素替代周期准备内膜，月经第3天开始，口服雌二醇地屈孕酮片(芬吗通，苏威制药，荷兰)红片4 mg，2次/d，连续服用10 d，根据患者的内膜情况调整用药剂量，当子宫内膜厚度≥8 mm时，改为口服芬吗通(苏威制药，荷兰)黄片4 mg，2次/d，同时阴道给药黄体酮软胶囊(安琪坦，Besins Manufacturing，比利时)200 mg，2次/d，连续服用10 d。黄体支持第6天在阴道超声引导下行胚胎移植，每周期移植1枚复苏囊胚，移植后继续黄体支持。

5.妊娠结局判定：囊胚移植后10 d检测血β-HCG，β-HCG≥25 U/L为HCG阳性；移植后28 d行阴道超声检查，子宫腔内可见孕囊为临床妊娠；妊娠≥28周的活产婴儿定义为活产。

6.观察指标：比较两组患者的活产率、HCG阳性率、临床妊娠率、流产率。活产率=活产分娩周期数/移植周期总数×100%；HCG阳性率=HCG阳性周期数/移植周期数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、患者一般资料比较

本研究共纳入699个单囊胚冻融移植周期，根据囊胚来源的D3胚胎形态学评分分为D3非优胚组(n=492)和D3优胚组(n=207)。两组间平均年龄、BMI、不孕类型、促排卵方案、受精方式和子宫内膜准备方法比较均无显著差异(P>0.05)；D3优胚组的D5、D7囊胚形成与D3非优胚组比较均无显著差异(P>0.05)，而D3优胚组的D6囊胚形成显著低于D3非优胚组(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般情况比较[(-±s)，n(%)]

二、D3优胚组和非优胚组来源囊胚的囊胚移植妊娠结局比较

D3优胚组来源囊胚的优质囊胚率、临床妊娠率和活产率均显著高于D3非优胚组来源囊胚(P<0.05)，两组间HCG阳性率和流产率比较均无显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 D3优胚组和非优胚组来源囊胚的冻融移植结局比较(%)

三、不同囊胚形成时间组中来源于D3优胚组和非优胚组的囊胚移植妊娠结局比较

根据不同囊胚形成时间分为3个亚组：D5囊胚组、D6囊胚组和D7囊胚组，比较各亚组中来源于D3优胚组和非优胚组的囊胚移植妊娠结局。

D5囊胚组的HCG阳性率、临床妊娠率和活产率均显著高于D6囊胚组和D7囊胚组(P<0.05)；D5囊胚组、D6囊胚组和D7囊胚组中来源于D3优胚组的囊胚移植活产率均高于来源于D3非优胚组的囊胚，但差异无统计学意义(P>0.05)；D6、D7囊胚组中来源于D3非优胚组的囊胚移植流产率均显著高于来源于D3优胚组囊胚(P<0.05)(表3)。

表3 不同形成囊胚时间优胚组和非优胚组的妊娠结局比较[n(%)]

四、不同年龄段来源于D3优胚组和非优胚组的单囊胚移植妊娠结局比较

根据患者不同年龄分为3个年龄段：<35岁组、35～40岁组和≥40岁组，比较不同年龄段中来源于D3优胚组和非优胚组的囊胚移植妊娠结局。

与≥40岁组比较，<35岁组和35～39岁组HCG阳性率、临床妊娠率和活产率均显著升高(P<0.05)；相同年龄段患者中，来源于D3优胚组的囊胚活产率均高于来源于D3非优胚组囊胚，但差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4 不同年龄段中来源于D3优胚组和非优胚组的囊胚移植妊娠结局比较[n(%)]

讨 论

胚胎质量是ART成功的关键因素。优先移植优质的胚胎可以提高妊娠率和活产率，减少流产率和产前并发症、缩短治疗时间。但是，对于没有优质D3胚胎的患者，是否选择评分差的D3胚胎来源的囊胚进行移植以缩短IVF治疗周期是困扰生殖医生的难题。

囊胚质量与卵裂期胚胎的质量高度相关。优质的卵裂期胚胎可以形成数量更多、质量更好、发育更快的囊胚，移植后的临床妊娠率和活产率更高。本研究发现，D3优胚组的优质囊胚率以及所形成囊胚移植后的临床妊娠率、活产率均显著高于D3非优胚组(P<0.05)，本研究结果与黄柳静等[7]研究结果一致。但也有研究者提出，囊胚形成率与D3胚胎的质量相关，而所形成的囊胚质量与D3胚胎质量无关。据研究推测，在D3胚胎向囊胚发育的过程中，随着胚胎基因组的激活，基因和代谢缺陷的胚胎将被自然淘汰，一部分胚胎似乎可以自我修复并最终发育成囊胚[1，8]。在本研究中，来源于D3非优胚组的胚胎仍有25.81%最终形成优质囊胚，尽管所形成囊胚的冻融移植活产率低于来源于D3优胚组所形成的囊胚，但移植后活产率仍可达到33.13%，这可能与胚胎的自我修复功能有关。

目前，大多数胚胎实验室采用卵裂期胚胎评分，通过静态的胚胎形态学观察对胚胎的质量进行评估[9]。分裂对称、碎片率低(<10%)、大小均匀、单核、具有均匀透明细胞质的胚胎常被评为卵裂期优质胚胎[10]。形态学观察操作简便、评估效率高，因此，受到临床医生的推崇。但是，该方法受评估者主观经验影响较大，而且只能反映出某些特定时间点的胚胎状态，不能准确评估胚胎的发育潜能[11]。有研究表明，评分差的卵裂期胚胎可以在体外培养到囊胚阶段，然后玻璃化冷冻复苏后进行移植，仍有可能成功分娩健康的婴儿[2]。黄柳静等[7]研究发现，对评分差的D3胚胎进行囊胚培养后移植的活产率可达26.7%。本研究发现，来源于非优胚组的囊胚冻融移植活产率为33.13%。因此，对于没有优质D3胚胎的患者，可进行囊胚培养，增加体外培养时间进而挑选出发育潜能较好的胚胎，再进行囊胚移植仍可获得较好的临床结局，可以最大限度地利用胚胎[6，12]。但是，也有研究发现，非优质卵裂胚所形成的囊胚移植后流产率显著高于优质卵裂胚[13]。本研究发现，来源于D3优胚组和非优胚组的囊胚冻融移植后的流产率比较并无显著差异，且流产率均低于20%。确切的机制不明，也可能与实验室采用的胚胎培养体系相关。

囊胚发育速度是影响ART妊娠结局的一个重要因素。D5与D6囊胚移植后临床妊娠结局是否有显著差异目前仍存在争议。有研究报道，在鲜胚移植周期中，D5囊胚移植的临床妊娠率高于D6囊胚，但是，在复苏周期中D5、D6囊胚移植后的临床妊娠率比较并无显著差异[14-15]，这可能与新鲜周期中D6囊胚与子宫内膜发育不同步有关。大多数研究显示，D5囊胚的复苏率、种植率及活产率均显著高于D6囊胚[16-18]；在行囊胚培养的D3胚评分相同的情况下，所形成的D5囊胚移植后的活产率仍高于D6囊胚[19]。本研究显示，在冻融单囊胚移植周期中，D5囊胚组的HCG阳性率、临床妊娠率和活产率均显著高于D6囊胚组和D7囊胚组(P<0.05)。由于大多数研究中移植的囊胚未进行胚胎移植前遗传学筛查(Pre-implantation Genetic Screening，PGS)，发育缓慢的囊胚有较高的染色体异常发生率，所以D6囊胚组非整倍体的发生率可能高于D5囊胚组[20]，从而增加了D6囊胚组早期流产率。Hashimoto等[21]研究发现，发育较迟缓的D6囊胚会增加异常纺锤体的发生率，并降低玻璃化冷冻后胚胎的种植率；D5囊胚移植结局优于D6囊胚的内在原因之一，可能是D5囊胚细胞DNA对于冷冻过程的抵抗力更强。然而，一项Meta分析发现，移植玻璃化冷冻复苏胚胎的妊娠结局很大程度上取决于子宫内膜的同步性，若D5和D6囊胚具有相近的囊胚评分，则冻融单囊胚移植能获得相似的妊娠结局[22]。Yang等[23]的研究结果也支持这一结论。

年龄是影响ART妊娠结局的另一个独立因素。本研究发现，无论在所移植的囊胚是来源于D3非优胚组还是D3优胚组，年龄<35岁组的临床妊娠率和活产率最高，其次是35～39岁组，年龄≥40岁组最低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，与既往研究报道[24]一致。而且，在相同年龄段中，来源于D3非优胚组和优胚组的囊胚移植活产率比较并无显著差异(P>0.05)。年龄是影响活产率的独立因素[25]，随着患者年龄的增加，胚胎的非整倍体率增加10%[26]，这也是高龄(≥40岁)患者IVF周期胚胎种植失败和流产的主要原因。

在大多数生殖中心中，常常选择D5或D6囊胚进行移植或冷冻，而对于发育缓慢者如D7囊胚给予丢弃处理。因为D7囊胚形成率低，而且冷冻过程将进一步损伤囊胚细胞，增加DNA碎片、促进凋亡基因转录，从而降低了冷冻囊胚发育潜能[27]。因此，对于D7囊胚的冷冻价值仍然存在争议。有研究发现，D7囊胚移植后的临床妊娠率为6.2%～42.9%[28]。本研究中，D7囊胚的临床妊娠率达到32.26%，活产率达到22.58%，即使来源于D3非优胚组的D7囊胚活产率也可达20.00%。需要强调的是，本中心对D7形成的囊胚直径≥18 mm才予以冷冻保存，对于未达到标准的囊胚仍然给予丢弃处理，从而提高了D7囊胚移植的临床妊娠率[29]。尽管D7囊胚仅占可用囊胚的5%，但是通过延长培养时间可以增加可用囊胚的数量，提高每个周期的可用胚胎数，从而提高取卵周期的累计妊娠率，特别是对于无优质D3胚胎的患者，进行囊胚培养后仍可获得一定的活产率[30]。但是，由于本研究中D7囊胚样本量较少，可能影响统计学分析结果，后期需要进一步扩大样本量进行验证。

综上所述，建议优先选用来源于优质D3胚胎的囊胚进行移植；对于评分差的D3胚胎延长培养至囊胚后，优先选择发育快的囊胚进行移植仍可获得良好的妊娠结局；对于D7囊胚仍有22.58%的活产率。因此，对于评分差的D3胚胎可培养至囊胚后再行冻融胚胎移植，不应当轻易丢弃D7囊胚，如此可以提高取卵周期的累计妊娠率和胚胎利用率，缩短患者获得临床妊娠的时间，减少患者的经济负担和心理负担。