PTEN和Notch1在非小细胞肺癌组织中表达及临床意义

张媛媛，马 静，何会娜，郭 银，李香兰，池 菲

(1.河北省胸科医院，河北 石家庄 050041 2.河北医科大学第四医院放疗科，河北 石家庄 050036)

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中大部分为非小细胞肺癌(Non small cell lung cancer，NSCLC)，约占肺癌的85%，且大多数患者确诊时已处于中晚期[1]。NSCLC患者具有较低的5年生存率，随着分子生物学的发展，分子靶向治疗日益受到关注[2]。癌基因异常表达导致的细胞异常增殖是肺癌发生的主要原因，也是癌细胞产生耐药性的主要机制之一[3]。第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)是一种抑癌基因，研究表明PTEN的异常表达与肺癌的发生、发展有关[4]。Notch信号通路是一个高度进化保守的信号传导网络，能够调节细胞增殖、分化[5]。Notch1属于Notch受体家族，多个研究表明Notch1促进NSCLC细胞的增殖和侵袭，促进NSCLC的发生发展[6,7]。研究表明胃癌细胞SCG7901和MKN74中敲除Notch1后，PTEN表达增加，且胃癌细胞的迁移和侵袭受到抑制[8]。本研究通过检测NSCLC组织和正常组织PTEN、Notch的表达，分析二者与NSCLC患者临床病理特征的关系，以期为NSCLC的分子靶向治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料:收集本院2016年1月至2017年12月收治的67例NSCLC患者癌组织标本，其中男42例，女25例，年龄31～75岁，平均年龄(51.26±10.34)岁，其中鳞状细胞癌29例，腺癌34例，其他肺癌4例；有吸烟史患者46例，无吸烟史患者21例；TNM分期I+II期45例，III期22例；高+中分化43例，低分化24例；发生淋巴结转移25例，未发生淋巴结转移42例。同期选取25例经组织病理学证实为正常肺组织标本为对照组。

1.2方 法

1.2.1免疫组织化学法检测NSCLC及正常组织中PTEN、Notch1的表达:将收集到的石蜡标本60℃烤箱烘烤，常规脱蜡至水，抗原修复，室温封闭，加入兔抗人PTEN、Notch1一抗(ab170941、ab52627，英国abcam公司，1∶100稀释)，4℃孵育过夜，加入山羊抗兔lgG H&L(ab205718，英国abcam公司，1∶2000稀释)，37℃孵育1h，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(ZLI-9017，北京中杉金桥生物技术有限公司)进行染色，苏木素复染，酸酒精短暂分化后，脱水、透明、封片。

1.2.2阳性结果判定:细胞质或细胞核内出现黄色或棕色为阳性染色。采用免疫反应积分(IRS)进行评分，IRS=阳性细胞百分比评分×阳性细胞染色强度评分。阳性细胞百分比评分：无阳性细胞(0分)，阳性细胞占比<25%(1分)，占比25%～50%(2分)，占比50%～75%(3分)，占比>75%(4分)。阳性细胞染色强度评分：无染色(0分)，浅黄色(1分)，棕黄色(2分)，棕褐色(3分)。以IRS≥3分为阳性，<3分为阴性。

1.2.3患者随访:以电话、微信、门诊复查等方式对NSCLC患者出院后进行随访。第一年每隔3个月进行一次随访，第二年开始每隔6个月进行一次随访，随访时间为36个月，记录患者生存状态。以患者死亡时间作为终点事件时间。

1.3统计学方法:统计软件SPSS20.0进行数据分析，计数资料采用n(%)描述，两组间差异比较采用χ2检验；χ2检验分析NSCLC组织中PTEN、Notch1的表达与患者临床病理特征间的关系；Kendall's tau-b法分析NSCLC组织中PTEN、Notch1的相关性；Kaplan-Meier生存曲线分析PTEN、Notch1与NSCLC患者预后之间的关系。COX回归分析影响NSCLC预后的因素。

2 结 果

2.1NSCLC组织及正常肺组织中蛋白PTEN、Notch1的表达:PTEN主要表达于细胞质和细胞膜，Notch1主要表达于细胞质和细胞核，见图1。与正常肺组织比较，NSCLC组织中蛋白PTEN阳性率显著降低，蛋白Notch1阳性表达率显著升高(P<0.05)。详见表1。

表1 NSCLC组织及正常肺组织中PTEN Notch1的表达

2.2NSCLC组织中PTEN、Notch1的表达与患者临床病理特征间的关系:NSCLC组织中PTEN阳性表达22例，阴性表达45例；Notch1阳性表达41例，阴性表达26例。NSCLC组织中不同年龄、性别、吸烟史、组织类型、TNM分期间PTEN、Notch阳性表达、阴性表达差异无统计学意义(P>0.05)；与未发生淋巴结转移和TNM I+II期的NSCLC患者比较，发生淋巴结转移和TNM III期的NSCLC患者PTEN阳性表达率显著降低，Notch1阳性表达率显著升高(P<0.05)。详见表2。

表2 Notch1 PTEN的表达NSCLC患者临床病理特征间的关系

2.3NSCLC组织中蛋白PTEN、Notch1的相关性分析:NSCLC组织中蛋白PTEN、Notch1表达呈负相关(r=-0.356，P<0.05)，详见表3。

2.4蛋白Notch1、PTEN表达与NSCLC患者预后的关系:随访期间，共有35例患者死亡。PTEN阳性表达组患者累积生存率(63.0%)高于阴性表达组(44.6%)；Notch1阳性表达组患者累积生存率(43.1%)低于阴性表达组(63.0%)，详见图2。

2.5COX回归分析影响NSCLC患者预后的因素:单因素COX分析表明，年龄、吸烟史、淋巴结转移、组织分化、TNM分期、Notch1阳性表达、PTEN阴性表达是影响NSCLC患者预后的危险因素(P<0.05)；多因素COX分析表明，TNM分期、Notch1阳性表达、PTEN阴性表达是影响NSCLC患者预后的危险因素(P<0.05)，详见表4。

表3 NSCLC组织中蛋白PTEN Notch1的相关性分析

表4 COX回归分析影响NSCLC患者预后的因素

图1 NSCLC组织及正常肺组织中PTEN、Notch1的表达(免疫组化法，×400)

图2 PTEN(左)、Notch1(右)与NSCLC患者预后的关系

3 讨 论

肺癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，其发生发展与遗传、环境、生活习惯等多种因素有关。肿瘤发生发展是涉及到多个基因变化的多因素和多步骤过程，包

括抑癌基因的失活，癌基因的激活以及癌相关基因的异常表达[9]。随着生物技术的发展，靶向治疗为肺癌的治疗提供了新方法。研究在NSCLC中差异表达的基因可能为NSCLC的分子靶向治疗提供临床依据。

PTEN基因是一种重要的抑癌基因，莫俊贤等[10]研究表明PTEN在肺腺癌组织中表达显著低于癌旁组织，且随着TNM分期的升高，PTEN表达降低。本研究结果表明NSCLC组织中蛋白PTEN阳性表达率显著低于正常肺组织，提示PTEN可能参与NSCLC的发生。癌细胞的异常增殖和侵袭是导致癌症发生发展主要机制之一。Shi等[11]研究表明miR-19a通过抑制PTEN的表达促进NSCLC细胞A549、H1299的增殖和迁移。本研究对不同PTEN表达的NSCLC患者临床病理特征进行比较发现，发生淋巴结转移和TNM3期的NSCLC患者PTEN阳性表达率分别低于未发生淋巴结转移和TNM分期为I+II期的NSCLC患者，而不同组织分化患者间PTEN阳性表达无差异。对NSCLC患者进行随访，结果表明NSCLC患者PTEN阳性表达组累积生存率显著高于阴性表达组。以上结果提示PTEN与NSCLC患者的临床病理特征和预后有关，猜测可能是PTEN抑制NSCLC细胞的异常分化有关，具体机制有待进一步深入研究。Notch是编码哺乳动物细胞中跨膜受体家族的一组基因，主要调控细胞增殖、分化和凋亡，影响细胞的正常生长，在机体稳态、血管生成和癌症发生中起重要作用,Notch受体家族有4个家族成员，其中Notch1是最常见的Notch受体，具有促癌作用[12]。Hu等[13]研究表明Notch1在胃癌组织中表达显著高于正常胃组织，且与胃癌的T细胞浸润水平呈正相关。本研究发现蛋白Notch1在NSCLC组织中的表达显著高于正常对照组，且与患者TNM分期有关，提示Notch蛋白可能与NSCLC的发生发展有关。Gao等[14]研究表明长链非编码RNA NBR2过表达通过降低Notch1表达抑制NSCLC细胞的上皮间质转化，抑制NSCLC细胞AsPC-1的细胞增殖和迁移。Notch1通过诱导上皮间质转化促进细胞的增殖和侵袭，从而促进癌症的发生发展，可能是Notch1在NSCLC发展中的作用机制。生存分析结果进一步表明Notch1阳性表达组NSCLC患者累积生存率显著低于阴性表达组患者，提示Notch1与NSCLC患者的预后有关。进一步研究Notch1在癌症发生发展中的可能作用通路，可能为NSCLC的靶向治疗提供依据。本研究还发现，NSCLC组织中Notch1与PTEN表达呈负相关，Li等[15]研究表明小孽碱通过抑制Notch1，增加PTEN的表达抑制PI3K/AKT信号通路，导致结肠癌细胞SW480的细胞周期停滞，抑制细胞的增殖，从而表现出抗肿瘤的作用。COX回归分析结果表明Notch1阳性表达、PTEN阴性表达是影响NSCLC患者预后的危险因素，猜测PTEN与Notch1的表达失调可能协同参与NSCLC的发生发展过程，具体机制有待进一步研究。

综上所述，PTEN、Notch1在NSCLC组织和正常肺组织中存在差异表达，且与NSCLC患者的淋巴结转移、TNM分期及预后有关，二者可能协同参与NSCLC的发生发展。然而本研究仅从临床水平检测了NSCLC组织中蛋白PTEN、Notch1的表达，下一步需结合细胞实验，探讨二者在NSCLC细胞恶性生物学行为中的作用机制，可能为NSCLC的靶向治疗提供参考依据。