银杏总黄酮对IL-1β诱导的髓核细胞凋亡及Nrf2/ARE信号通路的影响

李 静，黄娅芬，夏晓枫，唐家国

(1.湖北省武汉市第三医院骨科，湖北 武汉 430000 2.长江航运总医院骨科，湖北 武汉 430010)

腰椎间盘退变是引起腰椎疾病及腰腿痛的重要原因，据世界流行病学分析，我国每年罹患腰椎疾病的患者约达800～1000万人，严重影响我国国民的生活质量[1]。腰椎间盘退变机制及病理因素复杂，一直是骨科研究的重点[2]。近来研究发现髓核细胞衰老、凋亡、氧化应激及炎症反应等病理因素是导致腰椎间盘退变的主要原因[3]。但引起髓核细胞凋亡的分子生物学机制，还不甚明确。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路可调控细胞凋亡、氧化应激及炎症反应等生理活动来参与疾病的发展过程[4]，Nrf2入核后可激活抗氧化、抗炎途径，对髓核细胞炎症损伤及凋亡具有保护作用，逐渐受到骨科学者研究的重视[5]。另外，寻找抑制髓核细胞凋亡的有效药物，对治疗腰椎间盘退变，缓解患者腰椎疼痛有一定的临床意义。银杏总黄酮(total flavonoids of Ginkgo biloba，TFG)为银杏叶提取物中的重要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡等多种药理作用，且对阿尔茨海默症等神经系统退化性疾病的神经损伤及神经凋亡有一定改善作用[6]。但TFG对髓核细胞凋亡的影响还未见报道，本研究通过体外白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)诱导建立髓核细胞凋亡模型，探究TFG对髓核细胞凋亡及Nrf2/ARE通路的影响，以期为TFG的开发应用及腰椎间盘退变的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1细胞来源:人椎间盘髓核细胞(上海梵态生物科技有限公司，批号：FT-LY0104)。

1.1.2主要药物、试剂与仪器:TFG(北京仪化通标科技有限公司，原料药，纯度99%，批号：PRF00159)；DMEM培养基、IL-1β溶液(北京凯瑞基生物科技有限公司，批号：120026、140057)；CCK-8试剂盒(武汉科昊佳生物科技有限公司，批号：CK04-500T)；Nrf2通路抑制剂(Brusatol)(美国MCE公司，批号：HY-19742)；hochest 33258染色试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司，批号：KGA211)；活性氧荧光探针(DCFH-DA)(上海懋康生物科技有限公司，批号：MX4803-10)；Nrf2、ARE、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血红素加氧酶1(HO-1)、GAPDH单克隆抗体、羊抗人二抗(美国abcam公司，批号：ab2302、ab89443、ab255275、ab189491、ab89119、ab10003、ab10117)；化学发光显色试剂盒(上海士锋生物科技有限公司，批号：R1686)；酶标仪(深圳市恩科生物科技有限公司，型号：Sunrise)；荧光显微镜(南京贝登医疗股份有限公司，型号：CX43)；化学发光成像系统(北京原平皓生物技术有限公司，型号：Tanon 5200)。

1.2方 法

1.2.1细胞培养:取椎间盘髓核细胞常规复苏后，用含20%胎牛血清和DMEM培养基于恒温培养箱(37℃、5% CO2)中培养，并用胰蛋白酶进行消化传代。

1.2.2CCK-8法检测不同浓度TFG对椎间盘髓核细胞增殖活性的影响:取椎间盘髓核细胞分为正常组、IL-1β诱导组、二甲基亚砜(DMSO)组、TFG不同浓度组(5、10、20、40、80、160mg/mL)组，每组设置6个复孔(1×105个/孔)。正常组常规培养不做任何处理；IL-1β诱导组参照文献[7]加入浓度为10ng/mL的IL-1β溶液诱导髓核细胞凋亡；DMSO组加入浓度为10ng/mL的IL-1β溶液和0.1% DMSO溶液作为阴性对照；TFG不同浓度组加入浓度为10ng/mL的IL-1β溶液以及参照文献[8]设置剂量并加入浓度为5、10、20、40、80、160mg/mL的TFG溶液(TFG预先用0.1%的DMSO溶解)进行干预培养。各组均培养24h后取细胞，按CCK-8试剂盒说明书方法，加入CCK-8溶液继续培养2h后，用酶标仪读出各组细胞的OD值(450nm波长)，另取空白培养基进行OD检测作为空白OD值，根据公式细胞存活率(%)=[(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%，计算细胞存活率，存活率越大预示细胞增殖活性越高，并筛选出适宜的TFG浓度进行后续实验。

1.2.3细胞分组处理:将椎间盘髓核细胞分为正常对照组、IL-1β诱导组、TFG低(20mg/mL)、高(80mg/mL)剂量组、Nrf2通路抑制剂组(Brusatol组，0.2μg/mL)、TFG+Brusatol组(80mg/mL+0.2μg/mL)，每组设置6个复孔(1×105个/孔)。正常对照组不做任何处理，正常培养；除正常对照组外，其余各组均加入浓度为10ng/mL的IL-1β溶液诱导髓核细胞凋亡[7]，TFG低、高剂量组加入浓度为20mg/mL、80mg/mL的TFG溶液；Brusatol组参照文献[9]加入浓度为0.2μg/mL的Nrf2通路抑制剂(Brusatol)溶液；TFG+Brusatol组加入浓度为0.2μg/mL的Brusatol及80mg/mL的TFG溶液干预培养。各组均培养24h后进行后续实验。

1.2.4CCK-8法检测细胞增殖活性:取1.2.3项中处理后的各组细胞，按1.2.2项中CCK-8法操作方法检测髓核细胞增殖活性。

1.2.5hochest 33258染色检测细胞凋亡情况:取1.2.3项中处理后的各组细胞，按hochest 33258染色试剂盒说明书方法对各组细胞进行染色后，置于荧光显微镜下观察，各组随机选取5个视野，计数凋亡细胞数目(细胞核染色为亮蓝色的细胞)及细胞总数目(细胞核染色为亮蓝色的细胞数目+细胞核染色为均匀淡蓝色的细胞数目)，并计算细胞调亡率(细胞调亡率=凋亡细胞数目/细胞总数目×100%)。

1.2.6免疫荧光染色法检测细胞中活性氧(ROS)含量:取1.2.3项中处理后的各组细胞，加入DCFH-DA探针并于室温下孵育20min后，置于荧光显微镜下观察细胞染色情况，并随机取5个视野，用Image Pro Plus 5.0图像分析系统单位面积内绿色荧光强度强弱，以单位面积内荧光强度代表细胞中ROS相对含量。

1.2.7免疫荧光共聚焦法检测Nrf2入核情况:取1.2.3项中处理后的各组细胞，加入浓度为20μmoL/L的特丁基对苯二酚(TBHQ)处理45min、丙酮固定10min、0.25%曲拉通(TritonX-100)室温透化6min、用含1%牛蛋白血清室温封闭1h后，加入Nrf2特异性一抗(1：200)低温(4℃)孵育过夜，再用Aexa Fluor488荧光标记的二抗室温孵育1h后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光染核3min，用防猝灭液封片后于激光共聚焦显微镜下观察，拍照。

1.2.8蛋白免疫印迹法检测各组细胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、TNF-α、HO-1蛋白表达水平:取1.2.3项中处理后的各组细胞，用胰蛋白酶消化、蛋白裂解液4℃裂解25min后3000r/min离心15min取上清液提取总蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度。取25μg蛋白样品行上样、跑胶、转膜与电转反应、封闭后，加入一抗(Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、TNF-α、HO-1、GAPDH抗体，稀释倍数均为1∶1500，内参抗体GAPDH稀释倍数为1∶3000)，于4℃冰箱内孵育过夜，加入二抗(稀释4500倍的辣根过氧化物HRP)室温下孵育1.5h。用化学发光试剂盒显影后在化学发光成像分析系统下拍照并分析灰度值。每组试验重复3次。

2 结 果

2.1不同浓度TFG对椎间盘髓核细胞增殖活性的影响:与正常组比较，IL-1β诱导组、DMSO组细胞增殖活性降低(P<0.05)。与IL-1β诱导组比较，随着TFG浓度升高，细胞增殖活性逐渐升高，在80～160mg/mL时保持在稳定水平，其中20、40、80、160mg/mL TFG组细胞增殖活性与IL-1β诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05)。DMSO组与IL-1β诱导组比较、80mg/mL TFG组与160mg/mL TFG组比较，差异均无统计学意义(P<0.05)，选用20mg/mL、80mg/mL为TFG低、高剂量组进行后续试验。见图1。

图1 各组髓核细胞存活率比较

2.2TFG对椎间盘髓核细胞增殖活性的影响:与正常对照组比较，IL-1β诱导组细胞增殖活性降低(P<0.05)。与IL-1β诱导组比较，TFG低、高剂量组细胞增殖活性升高(P<0.05)，且TFG高剂量组高于TFG低剂量组；Brusatol组细胞增殖活性降低(P<0.05)。与TFG高剂量组比较，TFG+Brusatol组细胞增殖活性降低(P<0.05)。见表1。

表1 TFG处理后各组细胞增殖活性比较

2.3TFG对椎间盘髓核细胞凋亡率的影响:hochest 33258染色显示，凋亡细胞核染色为亮蓝色荧光，正常细胞核染色为均匀淡蓝色荧光。与正常对照组比较，IL-1β诱导组细胞凋亡率升高(P<0.05)。与IL-1β诱导组比较，TFG低、高剂量组细胞凋亡率降低(P<0.05)，且TFG高剂量组低于TFG低剂量组；Brusatol组细胞凋亡率升高(P<0.05)。与TFG高剂量组比较，TFG+Brusatol组细胞凋亡率升高(P<0.05)。见图2，表2。

图2 各组细胞hochest 33258染色图(×400)

2.4TFG对椎间盘髓核细胞ROS含量的影响:与正常对照组比较，IL-1β诱导组ROS含量升高(P<0.05)。与IL-1β诱导组比较，TFG低、高剂量组ROS含量降低(P<0.05)，且TFG高剂量组低于TFG低剂量组；Brusatol组细胞ROS含量升高(P<0.05)。与TFG高剂量组比较，TFG+Brusatol组ROS含量升高(P<0.05)，见图3，表3。

表2 各组细胞凋亡率比较

图3 各组细胞ROS免疫荧光染色图(×400)

表3 各组细胞ROS含量比较

2.5TFG对椎间盘髓核细胞Nrf2入核情况的影响:绿色荧光为Nrf2蛋白，蓝色荧光为细胞核。与正常对照组比较，IL-1β诱导组Nrf2入核数目升高(P<0.05)。与IL-1β诱导组比较，TFG低、高剂量组Nrf2入核数目升高(P<0.05)，且TFG高剂量组高于TFG低剂量组；Brusatol组Nrf2入核数目降低(P<0.05)。与TFG高剂量组比较，TFG+Brusatol组Nrf2入核数目降低(P<0.05)。见图4，表4。

图4 各组细胞Nrf2免疫荧光染色图(×400)

表4 各组细胞Nrf2入核数目比较

2.6TFG对椎间盘髓核细胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表达的影响:与正常对照组比较，IL-1β诱导组Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表达水平升高(P<0.05)。与IL-1β诱导组比较，TFG低、高剂量组Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达水平升高(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表达水平降低(P<0.05)，且TFG高剂量组Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达水平高于TFG低剂量组(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表达水平低于TFG低剂量组(P<0.05)；Brusatol组Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达水平降低(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表达水平升高(P<0.05)。与TFG高剂量组比较，TFG+Brusatol组Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达水平降低(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图5，表5。

表5 各组细胞Nrf2 ARE cleaved caspase-3 HO-1 TNF-α蛋白表达水平比较

图5 各组细胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表达免疫印迹图

3 讨 论

椎间盘退变引起的腰椎疼痛给患者及社会带来了巨大的经济负担。髓核细胞过度凋亡在椎间盘退变过程中起关键作用。Chen[10]等研究发现，椎间盘退变过程中，多种因素如异常机械负荷、椎间盘细胞基质合成与分解失衡等，会促进炎性细胞因子水平如IL-1β和TNF-α分泌，引起髓核细胞凋亡，导致椎间盘结构和功能的改变，进而加速椎间盘退变的病理过程，并认为减少炎症反应，抑制髓核细胞凋亡，可能是治疗椎间盘退变的有效策略。本研究用IL-1β体外诱导培养髓核细胞后，发现髓核细胞增殖活性降低，细胞凋亡率升高，并伴随着凋亡蛋白cleaved caspase-3及炎症因子TNF-α的显著升高，提示IL-1β诱导的髓核细胞凋亡模型造模成功。另外炎症反应又常伴随着氧化应激反应，且研究证实髓核细胞是ROS的来源之一。Li等[11]发现过多的ROS是导致椎间盘退变患者髓核细胞基质合成损伤及衰老凋亡的危险因子之一。本研究也在髓核细胞凋亡过程中检测到ROS含量的异常升高。

寻找抑制髓核细胞凋亡、炎症及氧化应激反应的药物，对抑制椎间盘退变具有重要意义。TFG为银杏叶中的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡等多种药理作用。樊丽超等[8]发现TFG可抑制脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应及活化进程，推测TFG可能通过抑制炎症反应，缓解神经系统炎症损伤。Arab-Nozari等[12]发现银杏叶提取物中的TFG可通过抑制氧化应激、炎症反应，保护肝脏细胞凋亡。但TFG是否对髓核细胞凋亡有保护作用还未见报道。本研究发现，随着TFG浓度的升高，IL-1β刺激下的髓核细胞增殖活性逐渐升高，在80～160mg/mL时达到稳定水平，且与IL-1β诱导组比较，TFG低、高剂量组髓核细胞增殖活性升高，并伴随着凋亡率、凋亡蛋白cleaved caspase-3、炎症因子TNF-α及氧化应激指标ROS含量的降低，提示TFG也可抑制髓核细胞凋亡，其抑制作用可能与抑制髓核细胞氧化应激、炎症反应有关。但其具体分子生物学机制还需进一步研究。

Nrf2/ARE通路与机体抗氧化、抗应激及抗凋亡关系密切，并越来越受到临床疾病研究的重视。Jiang等[13]研究发现氧化应激反应或代谢产物ROS可刺激Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)解聚，促进Nrf2转位入核与ARE结合，激活ARE下游抗氧化酶基因如HO-1的表达，进一步增强细胞清除ROS能力并抑制巨噬细胞活性，发挥抗氧化、抗炎作用。常洪泽等[14]发现Nrf2/ARE通路可作为细胞重要的防御机制，参与髓核细胞炎症、自噬及氧化应激过程，并推测Nrf2/ARE通路有望成为防治椎间盘退变的新靶点。本研究发现，IL-1β诱导组髓核细胞凋亡过程中，Nrf2入核数目增多，ARE蛋白及其下游蛋白HO-1表达水平升高，而Nrf2/ARE通路抑制剂Brusatol可使得Nrf2入核数目减少，ARE及其下游HO-1蛋白表达减少，细胞增殖活性降低，凋亡率、cleaved caspase-3、TNF-α蛋白及ROS含量升高，提示炎症刺激状态可诱导Nrf2/ARE激活，抵抗炎症反应及氧化应激损伤细胞，但这种激活不足以抵抗炎症及氧化应激引起的细胞凋亡，且抑制Nrf2/ARE激活可加重氧化应激及炎症损伤，加速髓核细胞凋亡。本研究采用TFG处理后，细胞Nrf2入核数目、ARE及其下游蛋白HO-1表达也显著升高，细胞表现出更高的增殖活性及较低的凋亡水平，且上述作用可被Brusatol逆转，提示TFG抑制髓核细胞凋亡作用可能与促进Nrf2/ARE激活有关。

综上所述，TFG可通过激活Nrf2/ARE通路，发挥抗炎、抗氧化、抗髓核细胞凋亡作用，为阐明髓核细胞凋亡及腰椎间盘退变的分子生物学机制提供一定理论依据，但髓核细胞凋亡的分子机制复杂，且途径较多，TFG抑制髓核细胞凋亡的其他途径还有待进一步探究。