耐性和敏感两种类型鲜食玉米苗期施用硝磺草酮后的转录组分析

李向楠, 吴振兴, 陈坚剑, 郭国锦,梅高甫, 王 剑, 吕桂华*,

(1. 浙江省农业科学院 玉米与特色旱粮研究所，浙江 东阳 322100；2. 浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所，杭州 310021；3. 浙江省农业科学院 公共实验室，杭州 310021)

硝磺草酮 (图式1) 属于三酮类除草剂，通过抑制4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶 (HPPD) 发挥作用[1]。在植物中HPPD 是酪氨酸分解代谢和质体醌生物合成途径的关键酶，HPPD 将酪氨酸转化为质体醌和α-生育酚[2]。质体醌参与光合作用中光系统II 到光系统I 的电子传递，并作为类胡萝卜素合成途径的关键酶番茄红素去饱和酶的辅助因子[3]。α-生育酚具有抗氧化功能，对植物体内活性氧的猝灭和清除具有重要作用。对硝磺草酮敏感的植物出现酪氨酸含量增加、类胡萝卜素降低、叶片退绿、株高和鲜重降低等现象[4]。在水稻中，当硝磺草酮施用量为125～704 g/hm2时，地上部鲜重减少10%～50%[5]。大豆苗后施用10%硝磺草酮悬浮剂后，植株上部复叶褪绿，药害严重时复叶干枯，植株萎蔫[6]。硝磺草酮对玉米具有选择性，同时施用量低，土壤残留少，对环境和后茬作物安全，在玉米种植过程中被广泛应用。但随着玉米品种的增加和硝磺草酮的推广使用，目前已有部分鲜食玉米品种表现出药害，因此，有必要了解硝磺草酮在鲜食玉米体内的代谢解毒机制。

硝磺草酮作为内吸型选择性除草剂，其对玉米的选择性依赖于较慢的吸收和快速的代谢。对玉米、狗尾草、藜和牵牛叶面喷施C14标记的硝磺草酮，24 h 后叶片中分别检测到45%、61%、90%和55%放射性标记，7 d 后玉米和狗尾草中检测到的放射性硝磺草酮含量分别为0.000 8 和0.29 μg/g[2]。与普通玉米相比，鲜食玉米特别是具有se和sh2胚乳突变基因的甜玉米，发芽率低和幼苗长势弱，更易受到除草剂药害影响，并因杂草竞争而减产[7]。O'sullivan 等评估9 个甜玉米品种对硝磺草酮的抗性，当苗后硝磺草酮施用量为200 g/hm2时，‘Calico Belle’和‘Del Monte 2038’均表现出明显药害，其中‘Del Monte 2038’的株高降低17%，产量降低28%[8]。张宏军等调查了4 个烟嘧磺隆敏感型玉米品种对硝磺草酮的响应情况。结果发现：随着施药量的增加，光合效率显著降低，其中白糯6 号降幅最大，且在施药10 d 后才能恢复到正常水平；此外，4 个玉米品种的株高和鲜重均明显降低[9]。由此可见，不同鲜食玉米品种对硝磺草酮的响应差异，导致鲜食玉米生产过程中除草剂的应用受到限制，但对其耐药性机制的研究较少[2]。

RNA-Seq 利用高通量测序技术对转录本进行直接测序，在提供全基因组信息、检测新转录本、等位基因特异性表达等方面均具有优势。目前RNA-Seq 已经成功应用于植物对除草剂耐受性的分子机制研究中。例如在牛筋草中，鉴定到28个与多胺、转运相关的基因，作为百草枯抗性的候选基因[10]。在水麻中，鉴定到除草剂靶基因，并对其中的HPPD、GS、EPSPS 和ALS 酶基因进行了序列分析[11]。在抗除草剂的稗中，鉴定出8 组除草剂靶位点基因和4 组非靶位点基因，作为参与除草剂抗性进化的潜在候选基因[12]。在水稻中，鉴定到可能参与二氯喹啉酸响应和解毒的基因，包括生长素相关基因GH3和OsIAAs，解毒相关家族基因细胞色素P450、谷胱甘肽转移酶、UGT、碱性磷酸酶和药物转运蛋白基因[13]。在玉米中，鉴定到13 个可能参与烟嘧磺隆代谢的候选基因，它们在耐烟嘧磺隆的玉米自交系中显著高表达[14]。本研究利用RNA-Seq 转录组分析来鉴定玉米硝磺草酮代谢中可能涉及的重要基因。这些基因可以作为潜在的候选基因来解释玉米对硝磺草酮的代谢形成机制，并为提高作物对三酮类除草剂的耐药性提供发展策略。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试玉米品种为耐性玉米自交系301 (T)和敏感玉米自交系276 (S)，由浙江省农科院玉米与特色旱粮研究所自主选育而成。75% 硝磺草酮水分散粒剂 (mesotrione WG，安徽中山化工有限公司)；超氧阴离子含量检测试剂盒 (BC1295，索莱宝生物科技有限公司 )；过氧化氢含量检测试剂盒(BC3595，索莱宝生物科技有限公司)；植物RNA 提取试剂盒 (DP432，天根生化科技有限公司)；反转录试剂盒 (TaKaRa，日本)；荧光定量试剂盒 (TaKaRa，日本)；丙酮 (分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；氯仿和次氯酸钠溶液(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；无水乙醇(分析纯，上海国药集团)。

ES120 电子天平 (厦门莱斯德仪器有限公司)；TGL-16M 冷冻离心机 (山东博科生物产业有限公司)；EJ60 小型罐装喷壶 (电压10.8 V，流速7.15 mL/s，Evika, 苏州嘉达园林工具有限公司)；UV-2000 分光光度计 (UNICO，美国)；叶绿素荧光成像系统 (Plant Explorer，荷兰)；艾本德移液器(100～1 000 μL，德国艾本德股份公司)；Light Cycler 480II real-time PCR system (Roche, 瑞士)；Agilent 2100 生物分析仪 (安捷伦科技公司，德国)。

1.2 试验设计

供试药剂为75%硝磺草酮水分散粒剂，试验前用水溶解，根据预试验结果施药剂量设为有效成分250 g/hm2。在玉米幼苗 3～5 叶期，采用茎叶喷雾法施药，药剂用量为250 g/hm2，同时设清水对照，每处理 3 次重复。

1.2.1 田间试验 试验于2020 年在浙江省农科院玉米与特色旱粮研究所进行 (29.16°N，120.13°E)，以本研究所自主选育的硝磺草酮耐性玉米自交系301 (T)和敏感玉米自交系276 (S)为材料。土壤为黏性土壤，肥力中等，其中有机质 15.4 g/kg， 全氮 1.66 g/kg，碱解氮 120.6 mg/kg，速效磷 7.08 mg/kg，速效钾 86.5 mg/kg。采用裂区设计， 硝磺草酮处理为主区，品种为副区。选取健康完整的玉米种子，直播于大田，行长 3 m，行距 0.6 m，8 行区，3 次重复。小区面积 14.4 m2。田间管理措施与大田相同。

1.2.2 盆栽试验 选取健康完整的玉米种子，经清水冲洗后用体积分数 75% 的乙醇消毒 1 min，用体积分数为 2%的次氯酸钠溶液消毒 8 min，然后用去离子水冲洗 3 次，直播于装有营养土的 6孔苗盘中，每孔播1 粒种子，置于温室大棚培养至3～5 叶期供试。

田间玉米幼苗分别于施药后 2、3、7 和 14 d采集处理组和对照组幼苗叶片，液氮速冻后于-80 ℃保存，用于活性氧产生速率、过氧化氢含量的测定，以及后续转录组测序。

苗盘中玉米幼苗分别于施药后0、1、2、3、4、5 和 6 d，取长势相近的玉米幼苗用于叶绿素荧光参数的测定。

1.3 不同玉米自交系的耐药性分析

1.3.1 超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量测定

超氧阴离子产生速率测定：称取 0.1 g 玉米叶片，加入1 mL 样品提取液 (试剂盒提供)，充分研磨后在4 ℃、 12 000 r/min 下离心 20 min，取上清液测定 530 nm 处吸光度值的变化，计算样品中超氧阴离子 的产生速率。

过氧化氢含量测定：称取 0.1 g 玉米叶片，加入 1 mL 丙酮，冰浴匀浆，于 8 000×g、 4 ℃ 下离心 10 min，取上清液测定415 nm 处的吸光度值，计算样品中的H2O2含量。

1.3.2 叶绿素荧光参数测定 分别取处理组和对照组幼苗进行叶绿素荧光参数测定。仪器工作参数为：激发光强度 800 μmol/(m2·s)， 光化光强度100 μmol/(m2·s)，图像采集速度 20 帧/s。

1.4 总RNA 提取

取硝磺草酮处理 48 h 的叶片提取总RNA，采用Agilent 2100 生物分析仪评估RNA 的完整性和总量，送北京诺禾致源公司进行转录组测序分析。

1.5 文库构建及转录组测序分析

取 12 个样本进行测序，包含耐性自交系对照组 (TC-1、TC-2、TC-3) 和处理组 (TT-1、TT-2、TT-3)，敏感自交系对照组 (SC-1、SC-2、SC-3) 和处理组 (ST-1、ST-2、ST-3)。利用待测序样品的总RNA 构建测序文库：首先，将Oligo(dT) 磁珠富集到的带polyA 尾的mRNA 打断成 300 bp 左右大小的片段；然后，以片段化的mRNA 为模板，随机寡核苷酸为引物合成双链cDNA；cDNA 经过末端修复、添加测序接头、PCR 扩增和纯化等过程，最终获得文库。

文库质检合格后，进行Illumina 测序，其基本原理是边合成边测序。在测序的flow cell 中加入 4 种荧光标记的dNTP、DNA 聚合酶以及接头引物进行扩增，测序仪捕获荧光信号，获得待测片段的序列信息。利用fastQC 软件检测原始数据的测序错误率和GC 碱基含量分布[15]。利用NGSQC Toolkit 过滤原始数据，获得Clean Reads 用于后续分析[16]。使用HISAT2 v2.0.5 软件将clean reads 与玉米B73 参考基因组进行比对，获取其在参考基因组上的定位信息[17]。采用StringTie拼接转录本并进行新基因预测[18]。

1.6 差异表达基因筛选及功能富集分析

利用Subread 软件中的featureCounts 计算映射到每个基因的读数，根据基因长度计算每个基因的FPKM(expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced)[19]。运用DESeq2 软件进行不同比较组合间的差异表达分析，以|log2(Fold Change)| ＞ 0和padj ≤ 0.05 作为差异表达基因 (DGEs) 的显著阈值[20]。利用Cluster Profiler 软件对不同比较组合间的差异表达基因进行基因功能注释(GO)和京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 富集分析，以padj ≤ 0.05 作为显著性富集的阈值。

1.7 候选基因分析

根据TC vs TT 及SC vs ST 获得的共同差异表达基因，按照差异倍数大于2、padj ≤ 0.05 进行筛选，结合基因功能注释信息，选取对照和处理(TC vs TT, SC vs ST) 条件下基因表达差异性较大的基因，作为鲜食玉米自交系不同耐药性的潜在候选基因。 以RNA-Seq 测序返还的耐性自交系对照组 (TC- 1、TC-2、TC-3) 和处理组 (TT-1、TT-2、TT-3)， 敏感自交系对照组 (SC-1、SC-2、SC-3) 和处理组 (ST-1、ST-2、ST-3) 的叶片RNA 为模板，合成cDNA。利用MazieGDB 数据库(https://maizegdb. org/) 获取基因的CDS 序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) 引物 (表1)。按照荧光定量试剂盒说明配制qRT-PCR 反应体系，PCR 反应条件为：95 ℃ 5 min，1 个循环； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，1 个循环。以GAPDH (Gene IDZm00001d049641)作为内参基因，3 次重复，基因相对表达量计算方法为 2-△△CT[21]。运用Dunnett’s tests 和Student’st-tests 进行统计分析。

表1 qRT-PCR 的引物序列Table 1 List of primers used for the qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 硝磺草酮处理对鲜食玉米的影响

在玉米3～5 叶期进行硝磺草酮处理，以分析耐性和敏感玉米自交系对硝磺草酮的响应。结果表明：250 g/hm2硝磺草酮处理7 d 后，敏感玉米自交系处理组植株叶片白化，部分叶片基部大面积褪绿。14 d 后敏感玉米自交系处理组植株均干枯死亡，而对照组植株正常生长 (图1 a, b)。耐性玉米自交系处理组植株未见明显损伤，14 d 后耐性玉米自交系处理和对照的生长情况相近 (图1 c, d)。

2.1.1 超氧阴离子 由图2a 可知，仅在硝磺草酮处理后的第3 天，耐性自交系TT 的超氧阴离子产生速率比对照TC 增加15.29%，差异达到显著水平，到第7 天比对照TC 增加4.43%。敏感自交系ST 的超氧阴离子产生速率在硝磺草酮处理后第3 天比对照SC增加4.29%，到第7 天比对照增加13.50% (图2b)。硝磺草酮处理2 d 后，耐性自交系TT 的超氧阴离子产生速率在0.023 3～0.026 8 μmol/(g·min FW) 之间，平均为0.024 8 μmol/(g·min FW)；敏感自交系ST 的超氧阴离子产生速率在0.029 5～0.030 6 μmol/(g·min FW)之间 ，平均为0.030 3 μmol/(g·min FW)；敏感自交系ST 比耐性自交系TT 的超氧阴离子产生速率平均高21.9%。以上表明，硝磺草酮处理7 d 后，敏感自交系ST 的活性氧积累量显著增加，严重破坏了植物体内的氧化还原平衡。

2.1.2 过氧化氢 硝磺草酮处理后，不同耐性自交系中的H2O2含量变化如图2 c, d 所示。相比于耐性自交系对照TC，硝磺草酮处理后第2 天、第3 天和第7 天，TT 的H2O2含量分别增加了106.9%、95.88%和121.4%，差异均达到显著水平。相比与敏感自交系对照SC，硝磺草酮处理后第2 天、第3 天和第7 天，ST 的H2O2含量分别增加了97.35%、38.02%和105.8%，差异均达到显著水平。然而，不同耐性自交系经硝磺草酮处理后，H2O2含量呈现出不同的变化趋势，敏感自交系ST 的H2O2含量随着处理后时间延长呈现增加趋势，而耐性自交系TT 中H2O2呈现下降的趋势。以上表明，随着时间的延长，硝磺草酮对敏感自交系造成的氧化损伤更加严重。

2.1.3 叶绿素荧光参数 最大光化学效率 (Fv/Fm)即PSII 反应中心最大光化学转化效率，反映植物叶片的光化学转化效率和潜在活性。硝磺草酮处理导致玉米敏感自交系 ST 的Fv/Fm 持续下降，与对照SC 相比，施药后0～6 d，ST 的Fv/Fm 分别下降6.6%、17.6%、29.2%、74.4%、66.1%、68.2%和78.3%，差异达到显著水平；硝磺草酮处理导致耐性自交系 TT 的Fv/Fm，在喷药后的第2 天、第3 天和第4 天，分别下降22.6%、15.4%和16.5%，差异达到显著水平，然而在喷药后的第5 天和第6天，TT 的Fv/Fm 恢复到与对照 (TC) 相近 (图3a)的水平。Fv/Fm 的测定结果表明，耐性自交系能够忍受硝磺草酮处理带来的损伤，较快恢复光合能力。

非循环光合电子传递速率 (ETR) 反映实际光强条件下的表观电子传递效率，它与光合速率之间具有很强的线性关系。如图3b 所示，硝磺草酮处理后，敏感自交系ST 的ETR 持续下降，与对照SC 相比，0 ～ 6 d 内ST 的ETR 分别下降6.1%、11.5%、27.5%、73.9%、63.1%、66.7%和80.5%，差异达到显著水平。硝磺草酮处理后，耐性自交系TT 的ETR 呈现先降低后增加的趋势，与对照相比，在喷药后的第2 天、第3 天和第4 天，分别下降29.3%、25.1%和21.0%，差异达到显著水平。然而在喷药后的第5 天开始，TT 的ETR 上升到与TC 相近的水平。ETR 的测定结果进一步表明硝磺草酮严重抑制了敏感自交系叶片的光合作用。

2.2 RNA-seq 测序数据分析

利用Illumina HiseqTM2500 高通量测序技术，对耐性玉米对照组 (TC-1、TC-2、TC-3) 和硝磺草酮处理组 (TT-1、TT-2、TT-3)，敏感玉米对照组 (SC-1、SC-2、SC-3) 和硝磺草酮处理组 (ST-1、ST-2、ST-3) 进行测序，共获得39 475 232 ～47 438 984 条原始序列 (raw reads)，去除接头序列和低质量碱基后得到高质量序列 (clean reads)37 859 598 ～ 45 672 390 条，每个样品中获得6.40 ～6.85 Gb 的高质量碱基 (clean bases)，其中质量达到Q20 和Q30 的碱基比例分别超过97.84% 和93.80%。将RNA-Seq 获得的高质量序列与B73参考基因组进行比对，发现有86.45% ～ 89.74%的序列能够比对到参考基因组上，其中能够比对到基因组唯一位置的序列超过83.41%，表明转录组测序的质量较高。样品间基因表达水平相关性是检验试验可靠性和样本选择是否合理的重要指标，根据样本所有基因的FPKM 值计算组内及组间样本的相关性系数，4 个样本的3 个重复间显示出良好的相关性，皮尔森相关系数r均大于0.8 (图4)。

2.3 硝磺草酮处理下敏感和耐性玉米的差异基因鉴定

根据样本的所有基因表达水平 (FPKM)，以|log2(Fold Change)| ＞ 0 和padj ≤ 0.05 为筛选阀值，在所有样品中共筛选到差异表达基因7 985个。在敏感玉米自交系中，处理和对照组间差异表达基因7 470 个，其中上调表达基因4 020 个、下调表达基因3 450 个；在耐性玉米自交系中，处理和对照组间差异表达基因1 021 个，其中上调表达基因526 个、下调表达基因495 个 (图5 a, b)。所有样品中共同差异表达基因507 个，在ST vs S C 中下调表达基因2 1 0 个、上调表达基因297 个；在TT vs TC 中下调表达基因240 个、上调表达基因267 个 (图5 c, d)。以上表明硝磺草酮处理后敏感玉米自交系和耐性玉米自交系之间的基因响应存在较大差异。

2.4 差异表达基因的GO 和KEGG 富集分析

对差异表达基因进行GO 富集分析，共有3 841个差异表达基因映射到GO 不同功能节点上，显著富集在包括生物过程、细胞组分、分子功能的272 个亚类。在生物学过程类群中富集最显著的条目为光合作用，共富集了123 个差异表达基因；在细胞组分类群中，类囊体是富集最显著的条目，共富集了206 个差异表达基因；在分子功能类群，叶绿素结合为富集最显著的条目，共富集到31 个差异表达基因 (图6)。以上表明硝磺草酮处理对玉米叶片中的光合作用可产生较大影响。

将差异表达基因比对到KEGG 数据库，获得基因注释信息以进一步探索基因功能。结果显示：共有1 136 个差异基因被注释到KEGG 数据库的112 条代谢路径中。对富集度最高的20 条代谢路径进行展示 (图7)，其中富集程度达到显著水平 (padj ≤ 0.05) 的代谢通路有10 个：4 个与光合作用相关的代谢通路，包括光合作用-触角蛋白(22 DEGs)、光合作用 (35 DEGs)、光合器官碳固定 (27 DEGs) 和卟啉与叶绿素代谢 (21 DEGs)；3 个与碳水化合物代谢相关通路，包括碳代谢 (90 DEGs)、淀粉与蔗糖代谢 (55 DEGs) 和糖酵解 (50 DEGs)；2 个氨基酸代谢通路，包括甘氨酸、丝氨酸与苏氨酸代谢 (21 DEGs) 以及氨基酸的生物合成 (73 DEGs)；1 个脂类代谢相关通路，甘油磷脂代谢通路 (40 DEGs)。以上显著富集到的代谢通路与光合作用、碳水化合物、氨基酸、脂类代谢等相关，涉及了生命活动的各个阶段，表明这些代谢通路在玉米响应硝磺草酮处理中可能具有重要作用。

2.5 硝磺草酮代谢相关基因的筛选与验证

细胞色素P450、谷胱甘肽S-转移酶 (GSTs)、柠檬酸转运蛋白、糖基转移酶、ABC 转运蛋白在植物体内除草剂代谢中发挥重要作用。根据基因功能注释及基因的差异表达情况 (|log2(Fold Change)| ＞1)，共筛选到9 个可能参与玉米硝磺草酮代谢的重要基因，编码的产物依次为：谷胱甘肽S-转移酶、细胞色素P450 家族72A 亚家族蛋白、细胞色素P450 家族709B 亚家族蛋白、酪氨酸氨基转移酶1、交替氧化酶2、线粒体内选择性NAD(P)H-泛醌氧化还原酶A1、脂氧合酶2、柠檬酸转运家族蛋白、腺苷甲硫氨酸脱羧酶原酶 (表2)。

表2 硝磺草酮处理下筛选的9 个差异基因Table 2 The 9 DEGs screened under mesotrione treatment

利用qRT-PCR 检测敏感和耐性玉米自交系处理组和对照组中这9 个基因的表达情况。结果表明：基因Zm00001d042099、Zm00001d044157、Zm00001d007462、Zm00001d002436、Zm00001d021804和Zm00001d042541均上调表达;Zm00001d040764均下调表达；Zm00001d032828和Zm00001d020544在敏感自交系中下调表达，而在耐性自交系中上调表达 (图8)。9 个基因的相对表达量变化趋势与转录组结果一致，相关性系数r为0.85，具有线性关系。

3 讨论

比较不同生长环境、组织、器官和发育阶段样本间的基因表达差异是揭示特定分子机制的有效方法。本研究对硝磺草酮处理前后敏感和耐性玉米叶片的转录组进行分析，发现敏感玉米中差异表达基因数目为耐性玉米差异表达基因数目的7.3 倍。在对烟嘧磺隆具有不同耐药性的近等基因系中，敏感型玉米自交系检测到2 100 个差异表达基因，而耐性玉米自交系中检测到1 398 个差异表达基因，前者是后者的1.5 倍[14]。本研究与该结果相似，推测可能是由于除草剂对敏感型玉米自交系造成的损伤更严重，因此诱导了更多基因的差异表达。差异表达基因的GO 和KEGG 富集分析显示，光合作用、类囊体和叶绿素是富集最显著的GO 条目，光合作用-触角蛋白、光合作用、光合器官碳固定和卟啉与叶绿素代谢是富集最显著的代谢通路。这与硝磺草酮抑制植物类胡萝卜素合成，导致叶片退绿，进而抑制光合作用的药害机理一致[4]。

前人的研究中，细胞色素P450、谷胱甘肽-S-转移酶、糖基转移酶和转运蛋白通过调控基因表达来参与除草剂的非靶标抗性，其中细胞色素P450氧化除草剂是植物主要代谢除草剂的途径[23]。Zm00001d044157编码细胞色素P450 72A 亚家族蛋白CYP72A123基因。在水稻和玉米中，细胞色素P45072A 亚家族蛋白CYP72A4、CYP72A5、CYP72A28和CYP72A31基因通过增强基因表达，参与乙酰乳酸合成酶抑制除草剂和磺酰脲类除草剂的代谢[14,24]。本研究中，硝磺草酮处理48 h 后，耐性和敏感玉米自交系中CYP72A123基因均显著上调表达，表明该基因可能参与了硝磺草酮的代谢。Zm00001d040764编码细胞色素P450 709B 亚家族蛋白CYP709B2。CYP450 709B 亚家族包括CYP709B1、CYP709B2和CYP709B3。在拟南芥中，C Y P 7 0 9 B 3基因通过上调表达，增强植物抵抗非生物胁迫的能力[25]。本研究中，硝磺草酮处理后，敏感和耐性玉米自交系中CYP709B2基因均下调表达，且敏感自交系中基因表达量下降更显著，表明CYP709B2基因能够响应硝磺草酮处理。本研究中，共筛选到2 个可能参与硝磺草酮代谢的细胞色素P450 家族基因Zm00001d044157和Zm00001d040764，硝磺草酮处理后二者表现出不同的基因表达模式，这可能是细胞色素P450酶家族功能复杂性所致。

谷胱甘肽转移酶催化还原型谷胱甘肽的巯基与除草剂代谢物的亲电子基团偶联，可提高除草剂代谢物的疏水性，使其更易于穿透细胞膜而被运输到细胞外，达到解除细胞毒性的目的[26]。经烟嘧磺隆处理后，敏感和耐性玉米自交系中GST1和GSTU6基因均显著上调表达[14]。本研究中，Zm00001d042099基因编码谷胱甘肽S-转移酶GST，硝磺草酮处理后敏感和耐性玉米中GST基因均显著上调表达，表明该基因可能参与了硝磺草酮的代谢。酪氨酸氨基转移酶 (TAT) 催化酪氨酸合成4-羟基苯丙酮酸 (pHPP)，pHPP 在羟苯丙酮酸双加氧酶 (HPPD)、羟基苯丙酮酸还原酶等一些列酶的催化下合成泛素、质体醌和生育酚[27]。在拟南芥中至少有两种同源的TAT 酶TAT1 和TAT2，TAT2 的催化活性和底物特异性远低于TAT1，TAT1 表达的减少分别导致酪氨酸和生育酚的积累增加和降低[28]。Zm00001d007462编码酪氨酸氨基转移酶 (TAT1)，硝磺草酮处理后耐性和敏感玉米自交系中TAT1基因均上调表达，且耐性自交系中表达增强更显著，表明TAT1基因可能通过促进生育酚的合成，缓解硝磺草酮带来的损伤。

交替氧化酶 (AOX) 是高等植物线粒体交替呼吸途径的末端氧化酶，通过消耗电子传递链上过多的电子和减少活性氧的产生，在植物抵抗逆境胁迫中发挥重要作用[29]。Zm00001d002436编码交替氧化酶AOX2，硝磺草酮导致耐性玉米和敏感玉米中AOX2基因均显著上调表达，表明该基因能够响应硝磺草酮的诱导。硝磺草酮处理后，植物体内氧化损伤严重。AOX2基因可能通过降低玉米中的活性氧含量，参与硝磺草酮的代谢。线粒体呼吸链复合物I 位于线粒体内膜，是呼吸链中最重要的蛋白复合体之一，通过电子传递形成跨膜质子梯度，驱动ATP 的合成[30]。Zm00001d021804编码线粒体内选择性NAD(P)H-泛醌氧化还原A1，是植物线粒体呼吸链复合体I 的重要组成部分。硝磺草酮导致耐性和敏感玉米中Zm00001d021804基因均显著上调表达，暗示其可能通过促进能量代谢，缓解硝磺草酮带来的氧化损伤。脂氧合酶(LOX) 是茉莉酸生物合成途径的关键酶，当植物遭受生物和非生物胁迫时，LOX基因诱导表达，与植物抗逆相关的茉莉酸类物质合成增加，进而诱导一系列抗逆相关基因的表达[31]。Zm00001d042541编码脂氧合酶LOX2，硝磺草酮处理后耐性和敏感玉米中LOX2基因均上调表达，且在耐性自交系中表达量更高，暗示了该基因可能通过促进抗逆性物质合成，增强玉米对硝磺草酮的耐受性。

柠檬酸盐转运蛋白属于多药物和有毒化合物外排家族，是生物中5 类解毒输出转运蛋白家族之一，其主要功能为次生代谢物的积累、重金属转运和激素信号转导[32]。Zm00001d032828编码柠檬酸转运家族蛋白，经硝磺草酮处理后，耐性玉米中该基因的表达显著上调，而敏感玉米中则显著下调，自交系中基因表达模式的差异可能对除草剂的代谢效率产生影响。腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC) 是多胺代谢途径的限速酶，其通过调控体内多胺含量来参与植物逆境胁迫响应。在拟南芥中，过表达SAMDC基因，多胺含量提高，植株抵抗非生物逆境胁迫的能力显著增强[33]。Zm00001d020544编码SAMDC，经硝磺草酮处理后，耐性玉米中SAMDC基因上调表达，而在敏感玉米中下调表达，暗示了该基因可能通过上调表达，提高玉米对除草剂的耐药性。

4 结论

本研究从生理学角度初步揭示了硝磺草酮对不同耐性的鲜食玉米自交系活性氧积累及光合作用的影响。利用RNA-Seq 分析了响应硝磺草酮的耐性和敏感玉米自交系的转录组。初步筛选出9 个可能参与硝磺草酮代谢的差异表达基因：Zm00001d042099、Zm00001d044157、Zm00001d007462、Zm00001d002436、Zm00001d021804、Zm00001d042541、Zm00001d040764、Zm00001d032828和Zm00001d020544，这些基因编码谷胱甘肽S-转移酶、细胞色素P450亚家族蛋白、酪氨酸氨基转移酶、交替氧化酶、线粒体内选择性NAD(P)H-泛醌氧化还原酶、脂氧合酶、柠檬酸转运家族蛋白和腺苷甲硫氨酸脱羧酶原酶。本研究结果将有助于了解玉米对硝磺草酮的代谢机制，可为挖掘除草剂代谢关键基因和认识其功能提供依据。