鸡粪堆肥高温腐熟菌的分离和鉴定及其初步应用

郑军荣，罗立津*，乐占线，刘建津，聂毅磊，贾纬，庄鸿

(1.福建省微生物研究所，福州 350007；2.福建清道夫环保科技有限公司，福州 350004)

0 引言

近年来，中国蛋鸡养殖业得到飞速发展，集约化程度不断提高，养殖规模不断扩大。由此也带来了鸡粪大量堆积问题，严重影响了养殖场周边的生态环境。而蛋鸡粪含有丰富的作物生长所需的矿质养分，但直接用作肥料会造成植物烧根死亡，并且其中的寄生虫、病毒和病菌，给生态环境造成巨大的危害[1]。目前，堆肥是无害化、资源化处理鸡粪的最有效方法之一，在减轻环境污染的同时可最大程度地实现资源化利用[2-3]。传统的高温堆闷发酵方法处理鸡粪，由于初期的微生物数量少，发酵周期长且腐熟程度低、恶臭气体仍很严重。堆肥反应器由于占地面积小，处理周期短，臭味得到有效控制，是当前大型畜禽养殖场的粪便资源化利用较为理想的好氧堆肥模式。目前，在堆肥反应器中利用微生物对鸡粪进行快速无害化处理是研究热点，学者已从不同来源的有机物料中，有针对性地分离了大量的菌株用于鸡粪的腐熟研究工作，且取得了一定的成果[4-6]。研究表明，接种有效的外源高温功能微生物进行鸡粪堆肥，不仅能够促进鸡粪堆肥的快速升温，有效地缩短腐熟周期，去除腐熟过程中产生的臭气，提高堆肥质量的效果[7-9]。但是，不同品种的鸡粪微生物菌群结构和特性并不相同，能发挥效能的菌株不仅与地域种类有关，而且不同的品种有一定的相关性[10]。因此，现有的鸡粪腐熟菌剂产品在实际推广应用中仍存在菌株的适应性差、作用单一、升温慢、腐熟周期长、臭气较重的问题。从鸡粪中分离的活性菌株，能够有效解决适应性问题并迅速成为优势菌，且通过多株不同代谢能力的菌株组合的协同发酵，完成单个菌株难以完成的复杂代谢作用，从而对鸡粪的有效转化[11]。

本研究利用LB培养基对鸡粪堆肥的高温微生物菌群进行分离、鉴定，并通过考察菌株对淀粉、蛋白质和纤维素的降解能力及抗菌活性，获得3～4株不同腐熟功能和抗菌活性的菌株，并制成复合菌剂，在小型堆肥反应器中用于鸡粪发酵腐熟除臭效果实验研究，为今后在蛋鸡粪堆肥反应器发酵中大规模推广提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡粪堆肥样品采集于福建省大丰山禽业发展有限公司的蛋鸡养殖基地。病原菌株大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和沙门氏菌(Samonella)由环境微生物研究室保存。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购于上海生物工程股份有限公司。PCR及测序引物(16S rRNA基因正向引物27F和反向引物1492R)由海生物工程股份有限公司合成。LB培养基购于北京陆桥公司。培养基如下：

1)淀粉水解培养基：可溶性淀粉0.2%， 蛋白胨1%， 酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH 7.0～7.2。

2)蛋白质降解培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5% ，琼脂2%，pH 7.0～7.2，脱脂奶粉1%(分开灭菌消后添加)。

3)纤维素降解培养基：酵母浸出粉0.05%，酸水解酪蛋白0.05%， KH2PO40.09%，MgSO4·7H2O 0.05%，羧甲基纤维素钠0.5%，琼脂2%，pH 7.0±0.1，刚果红0.02%。

1.2 方法

1.2.1 鸡粪堆肥中的微生物分离及纯化

将腐熟不同时间的样品，用稀释涂布的方法分离到Luria-Bertani(LB)培养基上并在50℃下培养2～3天，挑取单菌落进行划线分离纯化。

1.2.2 菌株的形态学和分子生物鉴定

纯化单菌落分别接种到LB培养基上培养，观察菌落形态。挑取菌落用革兰氏染色，显微镜观察细胞形态结构，并根据菌株的菌落形态和显微镜下特征进行初步分类。

采用细菌DNA试剂盒提取DNA，采用文献[10]的方法PCR扩增16S rRNA基因序列(引物27F为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R为5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，获得的DNA片段进行序列测定(委托尚亚生物完成)。将获得的菌株16S rRNA基因序列在Ezbiocloud中比对，确定同源性很高的种属，随后将所得序列与初步确定种的模式菌株序列运用MEGA5.0构建系统发育进化树，进一步确定最接近的种属。

1.2.3 菌株对淀粉、蛋白质和纤维素降解能力的测定

将菌株点样在淀粉水解培养基、蛋白质降解培养基和纤维素降解培养基上，37℃培养48 h或更长的时间，观察菌落周围是否有水解透明圈并测透明圈的大小，确定不同菌株对淀粉、蛋白质和纤维素的降解能力。

1.2.4 菌株的抗菌活性

将分离的活性菌株或病原菌，分别用肉汤液体培养基培养24 h，菌株生长良好。取病原菌0.1 mL涂布于相应的固体培养基上，随后将滴加了10 μL分离菌菌液的无菌小圆形滤纸贴于其上，培养48 h左右观察抑菌情况。

1.2.5 室内模拟堆肥

选择具有解淀粉、降解蛋白质、降解纤维素或抑菌效果的菌株用液体培养基进行振荡富集培养24 h，离心获取菌体进行冷冻干燥，取冻干菌渣与麸皮混合制成活菌总数达108cfu/g的复合菌剂。

将3份鸡粪与1份辅料(食用菌废弃菌糠)装入20 L不锈钢发酵桶中，调节水分含量在60%左右，接入5%的108cfu/g的复合菌剂，搅拌均匀，放于37℃恒温培养箱发酵8天，每24 h翻动堆料一次，并在堆制过程中观察发酵的温度、状态及气味等变化的差异，以不接种菌剂为对照。

1.2.6 指标测定和数据分析

每天翻堆之前记录多点的温度。样品中的水分、pH值、有机质、全氮、全磷和全钾的测定参考《NY 525-2012 有机肥料》的方法[12]。大肠杆菌采用大肠杆菌显色培养基平板计数法进行[13]。寄生虫卵计数采用血球计数板计数法进行[14]。

实验数据用平均值和标准差表示，采用SPSS 18.0软件进行统计分析，P<0.05为差异显著。

表 1 分离菌株的部分形态特征 Table 1 Morphological characteristics of isolated strains

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与筛选

用LB培养基对鸡粪堆肥微生物在50℃条件下进行分离筛选，获得一系列不同菌落形态的菌株。经多次纯化后，获得YJFJ4、YJFJ6、YJFJ8、YJFJ9和YJFJ12这5株菌，大部分菌落表面干燥、不透明、边缘不整齐，G+，有芽孢。通过菌落形态和显微形态观察可以确定，它们大部分为G+的芽孢杆菌(表1)。

2.2 菌株的分子生物学鉴定

对5株芽孢菌提取DNA、扩增16S rRNA基因序列、经测序后在Ezbiocloud中分析，结果扩增的DNA片段都在1 500 bp左右，每株都有几个与其同源性在99%以上的种。其中YJFJ4与特基拉斯芽孢杆菌(Bacillustequilensis)KCTC 13622(AYTO01000043)的相似性最高为99.86 %；YJFJ6与副地衣芽孢杆菌(B.paralicheniformis) KJ-16(KY694465)的相似性最高为99.76%；YJFJ8与暹罗芽孢杆菌(B.siamensis) KCTC13613(AJVF01000043)的相似性最高为99.72 %；YJFJ9与地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC 14580(AE017333)的相似性最高为99.65%；YJFJ12与枯草芽孢杆菌粪便亚种(B.subtilissubsp.stercoris)D7XPN1 (JHCA01000027)的相似性最高为99.84 %(表2)。利用5株菌及最相似种的模式菌株的16S rRNA基因序列构建系统发育树，结果显示，YJFJ4与特基拉斯芽孢杆菌KCTC 13622的进化距离近，YJFJ6与副地衣芽孢杆菌KJ-16的进化距离最近，YJFJ8与暹罗芽孢杆菌KCTC13613的进化距离最近，YJFJ9与地衣芽孢杆菌ATCC 14580的进化距离最近，YJFJ12与枯草芽孢杆菌粪便亚种D7XPN1的进化距离近(图1)。因此，结合形态学可以初步确定菌株YJFJ4与特基拉斯芽孢杆菌KCTC 13622为同一种；YJFJ6与副地衣芽孢杆菌KJ-16为同一种；YJFJ8与暹罗芽孢杆菌KCTC13613为同一种；YJFJ9-3与地衣芽孢杆菌ATCC 14580为同一种；YJFJ12与枯草芽孢杆菌粪便亚种D7XPN1为同一种。

图 1 5株菌的16S rRNA系统发育树Figure 1 The phylogenetic tree of 16S rRNA of 5 strains

注：CK为对照，下同。

图 3 菌株对鸡粪发酵过程中pH的影响Figure 3 Effects of strains on pH of chicken manure during fermentation

图 4 菌株对鸡粪发酵过程中含水率的影响Figure 4 Effects of strains on water content of chicken manure during fermentation

表 2 5株菌的16S rRNA测序结果比较Table 2 Comparative results of 16S rRNA sequencing of 5 strains

表 3 活性菌株对淀粉、蛋白质和纤维素的降解结果 Table 3 The degradation results of starch, protein and cellulose of 5 strains

表 4 活性菌株对不同病原菌的抑制效果 Table 4 Inhibitory effect of 5 strains on different pathogenic bacteria

2.3 菌株对淀粉、蛋白质和纤维素的降解

对菌株进行淀粉、蛋白质和纤维素的降解试验，结果见表3。结果表明,YJFJ4、YJFJ6、YJFJ8、YJFJ9和YJFJ12对淀粉、蛋白质和纤维素有不同程度的降解能力。YJFJ8降解淀粉和蛋白质能力接近且最好，但是降解纤维素能力最差。YJFJ4降解淀粉和蛋白质的能力仅次于YJFJ8，但是解淀粉能力优于蛋白质，降解纤维素的能力略优于YJFJ8。YJFJ12解淀粉和蛋白质的能力相当，解淀粉能力和纤维素能力仅次于YJFJ4。在这些菌株中,YJFJ6和YJFJ9解淀粉和蛋白质能力最差，解纤维素能力最好，解淀粉和纤维素能力接近且优于解蛋白质的能力。可能是由于这些菌株产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力大小不同，从而造成它们对降解淀粉、蛋白质和纤维素功能上有明显的差异。因此，在物质组分复杂的生态环境中，这些菌株共同生长对物质的降解效果会明显优于单一的菌株。

2.4 菌株的抗菌特性

对菌株进行抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的试验。结果显示，YJFJ4和YJFJ12对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有抑菌圈但是不透明仍有部分生长，抑菌作用不明显；YJFJ6和YJFJ9对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌圈但是不透明，仍有部分生长，而对沙门氏菌有明显的透明圈，且抑制作用明显。YJFJ8对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有明显的抑制作用而对大肠杆菌不明显(表4)。因此，可以确定在低温条件下，这些菌株对不同的病原菌抑制能力有一定差异，在病菌多样化的生态环境中共同生长对病原菌的抑制效果会明显优于单一的菌株。

2.5 菌株复合发酵对鸡粪堆肥温度、pH和含水率的影响

利用YJFJ4、YJFJ6、YJFJ8、YJFJ9和YJFJ12在37℃条件下对鸡粪进行复合发酵试验，以不加菌发酵为对照，测发酵8天内温度、pH和含水率，结果见图2～4。

温度是影响微生物活动和堆肥发酵过程的关键因素，温度的高低决定堆肥进程的快慢。从图2可知，在整个的发酵过程中前期快速上升后期缓慢下降。添加菌株发酵1天堆肥温度迅速上升到50℃，3天后最高温达到57 ℃左右，而对照发酵1天堆体温度缓慢上升到42℃左右，4天后最高温到50℃左右，添加菌株发酵温度上升快而且高，效果显著。发酵一定时间后，微生物生长活力减弱，温度开始下降，发酵8天温度接近初始温度，但是整个过程中，添加菌株发酵的温度差异极显著(P<0.01)，始终高于纯鸡粪发酵的对照组。推测菌株加入鸡粪中后，足够数量的菌株利用鸡粪中的营养物质迅速生长成为优势菌，缩短了发酵的延迟期；同时菌株生长释放大量的热量，促进发酵温度的迅速提升；迅速升高的温度加速了物质的分解和鸡粪中原有微生物的生长，迅速分解的营养物质又能够进一步加速微生物的生长，从而促进鸡粪的发酵降解腐熟更加彻底，缩短发酵周期。此外，高温会使部分微生物的生长受到抑制，从而引起温度的下降，而高温菌的添加能够延长堆肥高温发酵的时间，有利于堆肥腐熟的顺利进行，同时杀死大部分的致病菌、寄生虫及其卵。

pH对微生物的正常生长发酵至关重要，除酵母和霉菌外，大部分的微生物适合生长的pH范围为中性微偏碱性。从图3可知，在整个堆肥发酵过程中pH较高，且均为先升后降的变化趋势。与对照相比，添加菌株发酵后堆肥的pH值均显著低于对照组(P<0.01)，且在发酵结束时pH值下降至7.9，而对照组的pH值则达到8.4，结果表明在鸡粪局部的厌氧发酵条件下，发酵前期鸡粪中的含氮有机质分解产生大量的NH3，促进pH值的上升，随着部分NH3挥发和硝化菌硝化产生的H+使pH值降低；添加菌株发酵使鸡粪的微生态菌群结构生变化，从而改变了物质消化分解的途径，减少NH3的产生，抑制pH的快速上升。因此，添加菌株复合发酵能够控制堆肥的pH值，避免pH值过高而不利于微生物的生长，同时控制氨气的排放。

固态发酵中物料的含水率对微生物生长有很大的影响，适度的水分含量有利于菌株的生长，但是水分也影响了氧气的传递。从图4可知，添加菌株发酵组和对照组的含水率随着发酵时间的延长都下降明显，但是添加菌株发酵组的含水率显著低于对照组(P<0.01)，且发酵8天时，水分挥发的速率明显快于对照组。这说明鸡粪添加菌株后，菌株迅速生长释放大量的热量引起水分的迅速挥发，而水分的迅速减少增加了堆料的通透性，有利于氧气的传递和菌株的进一步生长，从而进一步加速温度的提升和水分的挥发，促进堆体的进一步发酵腐熟。

2.6 菌株复合发酵对鸡粪堆肥及臭气的影响

添加菌株复合发酵鸡粪8天后，堆体变小，颜色变为棕褐色，轻微臭味，较发酵前干燥、松散，而对照组的堆体臭味浓烈、黏稠，添加菌株复合发酵效果明显优于对照组(表5)。推测菌株加入鸡粪后利用鸡粪中的营养物质迅速繁殖生长。随着发酵的进行，鸡粪中的大部分物质被有效的分解利用，导致堆体体积逐渐变小、变色，大量水分的挥发使得堆肥更干燥和疏松。此外，迅速生长的菌株与鸡粪中原有的微生物抢夺营养物质，竞争性地抑制了腐败微生物的生长，阻断了厌氧条件下蛋白质、氨基酸等被消化降解产生的氨气、硫化氢、甲胺、三甲胺和乙烯醇等难闻气味物质的可能，减少了臭气的排放。

2.7 菌株复合发酵对鸡粪堆肥大肠杆菌和寄生虫卵的影响

从表6可以看出, 发酵前鸡粪中含有大量的大肠杆菌和寄生虫卵，随着发酵的进行，对照组和添加菌株发酵组的大肠杆菌和虫卵数量都在逐渐减少。发酵8天时,添加菌株发酵组中的大肠杆菌数下降了3个数量级，为2.35 lg cfu/g，且比对照组少1个数量级；寄生虫卵的死亡率达到83.01%，极显著高于对照组(P<0.01)。结果表明，堆温的控制及菌株的添加对于杀灭致病菌至关重要。在发酵初期外源菌株生长繁殖对不同病原菌有协作抑制作用，发酵温度的迅速提高及高温时间的延长能够更好地杀死病原菌和寄生虫，提高堆肥的品质。

表 5 菌株复合发酵鸡粪堆肥感官及气味的变化 Table 5 Changes in sensory and odor of chicken manure fermented by strains

表 6 菌株复合发酵鸡粪堆肥大肠杆菌和寄生虫卵的变化 Table 6 Changes of E.coli and parasitic eggs in chicken manure compost fermented by strains

表 7 菌株复合发酵鸡粪堆肥养分的变化 Table 7 Changes of nutrients in chicken mature compost fermented by strains

2.8 菌株复合发酵对鸡粪堆肥养分的影响

对发酵8天的鸡粪堆肥检测其相关养分指标。从表7可以看出, 添加菌株复合发酵组的有机质、总钾和总磷都极显著高于对照组(P<0.01)，总氮与对照组差异不明。结果表明，添加菌株使鸡粪发酵更完全，从而改变堆肥中的部分养分含量，有利于提高堆肥的品质。

3 讨论与结论

鸡粪中不仅含有大量的淀粉、蛋白质和纤维素且含有大量的微生物。鸡粪堆肥就是利用鸡粪自身的微生物对这些物质进行发酵降解，达到腐熟目的。近年来,学者对不同来源的鸡粪中的微生物种群进行研究，发现不同来源的鸡粪微生物组成和种类并不完全相同[15-16]。本实验组前期也对来自福建不同养殖场的鸡粪堆肥微生物进行了研究，发现鸡粪中微生物与鸡本身生长时期、养殖模式和环境的变化有很大的相关性。尽管不同鸡粪中的微生物确实有一定的差异，但是在堆肥高温期都有各种芽孢杆菌，可能是堆肥中腐熟的关键优势菌。

鸡粪微生物组成复杂，利用特定的培养条件，能够迅速地获得目的菌株，分子生物学方法能够对大量的菌株快速鉴定[5]。本实验采用LB培养基在50℃条件下对鸡粪堆肥中的高温菌进行分离，获得5株不同形态的菌株，经形态学初步鉴定后，对菌株进行16S rRNA序列分析，确定它们分别是特基拉斯芽孢杆菌YJFJ4、副地衣芽孢杆菌YJFJ6、暹罗芽孢杆菌YJFJ8、地衣芽孢杆菌YJFJ9和枯草芽孢杆菌粪便亚种YJFJ12。研究表明，部分芽孢杆菌能有效减少鸡粪便中氨、硫化氢等臭味气体的产生[4]。由此可见，尽管这些菌株不是新种，但是不同来源的菌株即使是相同的种也有功能的差异性，有潜在的研究价值。分子生物学对芽孢杆菌的鉴定有很大的帮助，但是要精确的鉴定还需做大量的工作。

鸡粪堆肥发酵中，微生物起着至关重要的作用，不同微生物能够通过协作，降解淀粉、蛋白质和纤维素等有机物，来影响发酵过程中气体的排放及腐熟的程度[17-18]。杨伟平等[19-20]将具有蛋白质、纤维素分解能力的芽孢杆菌用于畜禽粪便的堆肥发酵，发现堆肥不仅能够快速升温，同时粪便中的有机质和粗纤维也被加速降解，氨和硫化氢气体的释放也被抑制。本研究得出YJFJ4、YJFJ8和YJFJ12具有较强的蛋白质和淀粉降解能力，而YJFJ6和YJFJ9具有较强的纤维素降解能力，对病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌都有不同程度的抑制作用。结果表明，这些菌株的降解功能和抑制作用并不完全相同，对于营养成分复杂、恶臭气体多样混合的鸡粪，复合使用能够起到协同发酵，减少恶臭气体排放的效果。将这些菌株添加到鸡粪中发酵，发现能够缩短发酵的延迟期，提高发酵温度和延长高温时间，抑制pH的升高，加速水分的释放，同时减少臭气的产生，促进腐熟的完全。若将复合菌剂加入鸡粪后可明显改变鸡粪中的微生物菌群结构，成为优势菌群并发挥相应功能，从而达到提升除臭率的目的。对堆肥发酵8天后鸡粪中的大肠杆菌、寄生虫和养分进行分析发现，菌株的添加可以更好地减少大肠杆菌的数量，提高寄生虫的死亡率，及提高堆肥中有机质、总磷和总钾的含量。结果表明在发酵升温前期，复合菌株产生的某种物质可能对致病菌的生长有抑制，同时病原菌生长所需的营养物质被竞争性地争夺从而抑制病原菌的生长，加上菌株迅速生长释放大量的热量能够有效杀死部分的病原菌和寄生虫，而且温度越高，效果越明显。由于腐败的病原菌生长被抑制，产生的恶臭物质会相应减少。因此，可以确定，将分离自鸡粪的高温菌株的复合使用于堆肥反应器中鸡粪发酵，能够有效地缩短发酵延迟期，提高发酵速度和温度，协同发酵促进腐熟的完成，减少臭气的排放，提高堆肥的品质。