生肌膏对大鼠肛周脓肿术后创面愈合的促进作用及其可能机制▲

罗泽琴 田兴中 张晓飞 司华清

(河北省张家口市第五医院肛肠科，张家口市 075000，电子邮箱：lzq32156@163.com)

肛周脓肿是由细菌感染引发的急性或慢性化脓性疾病，其发病部位包括肛门、肛管及直肠周围软组织[1]。肛周脓肿主要表现为肛门灼热、排便疼痛等，若治疗不当会导致反复发作，甚至发生感染性休克，严重影响患者的生活质量[2]。目前，肛周脓肿的主要治疗手段为脓肿切开引流术，但由于病变位置特殊,患者术后创面愈合缓慢[3]，因此，迫切需要寻找有效的药物以促进肛周脓肿术后创面的愈合。研究表明，Notch1信号通路能够促进角质形成细胞的迁移和增殖，在促进皮肤伤口愈合和组织修复中起至关重要的作用[4]。生肌膏在临床上主要用于慢性创面愈合，可促进创面肉芽组织生长，效果显著[5]，但其促进肛周脓肿术后创面愈合的效果及作用机制是否与Notch1信号通路相关尚不明确。本研究通过建立肛周脓肿大鼠术后创面模型，探讨生肌膏促进肛周脓肿术后创面愈合的效果及作用机制，以期为肛周脓肿术后创面的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 实验动物：无特定病原体级SD大鼠65只，8周龄，体重(200.0±10.0)g，均为雌性，购自上海剑钝生物科技有限公司，动物生产许可证号SCXK(沪)2019-0027。经医院动物伦理委员会批准，并遵守3R保护原则进行实验。

1.1.2 主要药品与试剂：生肌膏由本院药房自制，主要成分有生血余60 g、炉甘石250 g、象皮90 g、生地黄120 g、当归60 g、生石膏150 g、龟甲120 g；Masson三色染色试剂盒(批号：G1340)、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)试剂盒(批号：G1120)、RIPA裂解液(批号：R0010)、ECL发光液(批号：PE0010)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(批号：SEKH-0047)、白细胞介素(interleukin，IL)-1α ELISA试剂盒(批号：SEKH-0001)、IL-6 ELISA试剂盒(批号：SEKH-0013)均购自北京Solarbio公司；Notch1兔抗大鼠多克隆抗体(批号：PA5-95827)和β-肌动蛋白(β-actin)兔抗大鼠多克隆抗体(批号：PA1-183)和山羊抗兔lgG(H+L)二级抗体(批号：A32731)均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 主要仪器：CX41生物显微镜购自日本Olympus公司；Gel DocTMXR+型凝胶成像仪和T100型PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备：参考文献[6]制备肛周脓肿大鼠术后创面模型。使用随机数字法随机选取45只大鼠，采用1.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉后固定于操作台，碘附常规消毒，局部备皮，在大鼠背部取直径为1.5 cm的创面伤口，深至肌层，止血后滴加1.0 mL粪液(正常人新鲜粪便20 g溶解于10 mL生理盐水，5 000 r/min离心10 min后取上清液)，用医用纱布覆盖创面，固定48 h，于(60.0±5.0)%湿度、光照与黑暗每12 h交替的环境中饲养，创口出现脓性分泌物，有粪臭味即为建模成功。本研究建模成功40只大鼠，经手术清除脓肿，生理盐水清洗，纱布覆盖48 h后用于后续实验。

1.2.2 实验分组及创面处理：将40只建模成功的大鼠按随机数字法分为模型组(n=20)和生肌膏治疗组(n=20)。肛周脓肿术后48 h，每天清晨在创生肌膏治疗组大鼠面滴加人新鲜粪液0.5 mL，30 min后用生理盐水清洗，碘附消毒并外涂厚度约为1 mm生肌膏完全覆盖创面，更换纱布，持续18 d。模型组大鼠每天在相同时间、相同方法给予术后创面滴加粪液、清洗并消毒，更换纱布，但不给予药物处理，持续18 d。取剩余20只大鼠按照1.2.1方法仅在大鼠背部行直径为1.5 cm的创面伤口，未滴加粪液，每天在相同时间滴加生理盐水0.5 mL，消毒后更换纱布，设置为对照组。

1.2.3 创面形态学观察：于每次换药或更换纱布时，按随机数字法选取各组10只大鼠观察术后创面组织的肿胀程度、组织生长状态等，估算大鼠在创面处理前(切除脓肿48 h后即刻)以及创面处理后3 d、8 d、13 d和18 d的创面面积，计算愈合率。愈合率=[(切除脓肿48 h时的创面面积-观察时的创面面积)/建模成功时的创面面积]×100%。

1.2.4 Masson染色实验：分别于创面处理后3 d、13 d，按随机数字法处死各组大鼠5只，取大鼠肛周脓肿术后愈合组织，行石蜡包埋、切片，根据Masson试剂盒说明书对组织切片进行染色，显微镜下观察组织病理状态。生肌膏处理后18 d，处死各组剩余大鼠，按照上述方法获取各组肛周脓肿术后创面愈合组织，一部分用于制作切片，作Masson染色用于后续实验，将其余组织置于-80℃环境中保存备用。

1.2.5 HE染色观察大鼠肛周脓肿术后创面愈合组织表皮生长情况：选取1.2.4中各时间点的大鼠愈合组织切片，经HE染色后，显微镜下观察毛细血管和成纤维细胞变化情况。

1.2.6 实时荧光定量PCR法检测Notch1 mRNA的相对表达水平：取1.2.4中-80℃保存的各组大鼠创面组织90 mg，解冻匀浆后，4℃下10 000 r/min离心10 min取上清液，使用RNeasy Mini Kit(上海北诺生物科技有限公司，批号：74106)提取各组总RNA，反转录得到cDNA(反转录试剂盒购自上海科敏生物科技有限公司，批号：205311)，然后进行实时荧光定量PCR反应(PCR试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司，批号：QP-01011)，以β-actin为内参，测定Notch1 mRNA相对表达水平。Notch1 mRNA和β-actin引物序列均由生工生物工程股份有限公司设计合成，见表1。反应体系共24 μL；反应条件：50℃、2 min，95℃、10 min，95℃、15 s，40个循环，60℃、1 min退火。以2-ΔΔCt计算Notch1 mRNA相对表达水平。

表1 Notch1和β-actin引物序列

1.2.7 蛋白免疫印迹实验检测Notch1蛋白相对表达量：取1.2.4中-80℃保存的各组大鼠创面组织30 mg，制备匀浆液，使用RIPA裂解液提取各组组织总蛋白，二喹啉甲酸法检测蛋白总量，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、TBST清洗后，依次加入一抗Notch1(1∶800)和β-actin(1∶1 000)，低温过夜，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST清洗后，曝光显影，采用Gel DocTMXR+型凝胶成像仪分析各组条带，Notch1蛋白相对表达量=Notch1条带灰度值/β-actin灰度值。

1.2.8 ELISA法检测TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平：取1.2.4中-80℃保存的各组大鼠创面组织0.05 g，制备匀浆液，根据TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒说明书，检测各组肛周脓肿术后创面愈合组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 25.00软件进行统计学分析。计量资料采用(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠肛周脓肿术后创面形态学及创面愈合率的比较 创面处理后3、8、13和18 d，3组大鼠的创面愈合率差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中创面处理后3、8、13和18 d，3组大鼠创面愈合率由高到低均为生肌膏治疗组、对照组、模型组(均P<0.05)。创面处理后3、8、13和18 d，与对照组相比，模型组创口愈合缓慢；与模型组相比，生肌膏治疗组大鼠创口愈合情况明显增加，创口减小，且愈合效果优于对照组。见图1和表2。

建模成功时 创面处理后3 d 创面处理后8 d 创面处理13 d 创面处理第18天

表2 不同时间点3组大鼠创面愈合率的比较(x±s，%)

2.2 3组大鼠的创面组织学变化 Masson染色法结果显示：随时间的延长，各组大鼠肛周脓肿术后创面组织的胶原纤维合成数量呈增加趋势；相同时间点，模型组胶原蛋白的形成速率最慢、数量最少，生肌膏治疗组的胶原纤维合成数量最多，对照组次之。见图2。HE染色结果提示：随时间的延长，各组大鼠肛周脓肿术后创面组织表皮生长状态逐步改善，表皮厚度逐渐增加；同一时间点，模型组大鼠肛周脓肿术后创面组织表皮生长状态最差，表皮厚度最薄；生肌膏治疗组大鼠肛周脓肿术后创面组织表皮厚度明显增加，表皮组织形态明显完善，对照组介于模型组和生肌膏治疗组之间。见图3。

图2 3组大鼠创面愈合组织学变化(Masson染色，×200)

图3 3组大鼠创面组织HE染色结果(×200)

2.3 3组大鼠肛周脓肿术后创面组织Notch1蛋白及mRNA相对表达水平的比较 3组大鼠创面组织的Notch1蛋白及mRNA相对表达水平，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中生肌膏治疗组、对照组、模型组大鼠创面组织的Notch1蛋白及mRNA相对表达水平均依次降低(均P<0.05)。见图4和表3。

图4 3组大鼠创面组织中Notch1蛋白表达的电泳图

表3 3组大鼠创面组织Notch1 mRNA和蛋白相对表达水平的比较(x±s)

2.4 3组大鼠创面组织中TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平的比较 3组大鼠创面的TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中模型组、对照组、生肌膏治疗组大鼠创面组织的TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平均依次降低(均P<0.05)。见表4。

表4 3组大鼠创面组织中TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平的比较(x±s，pg/mL)

3 讨 论

肛周脓肿属于临床常见肛肠科疾病，主要由葡萄糖球菌、大肠杆菌、链球菌或其他厌氧细菌感染引起[7]。手术治疗肛周脓肿后创面容易发生水肿、疼痛和炎症反应，导致并发症发生风险增高，而有效的术后药物治疗是肛周脓肿术后创面愈合的关键[8]。南宋时期，《外科精要》记载“治谷道前后生痈,谓之悬痈”，将肛周脓肿命名为“悬痈”；至清代《医门补要》中提出“肛痈”病名，一直被后代医家沿用至今[9]。生肌膏是中医常用的伤口愈合治疗药方之一，包含当归、甘草、白芷、紫草和血竭等重要成分，具有很好的临床疗效[10]。李志等[11]研究发现，湿润生肌膏能够促进肛瘘术后创口肉芽组织形成，加快伤口愈合；贾湘隆等[12]的研究表明，回阳生肌膏对糖尿病大鼠阴证疮面愈合具有促进作用；此外，还有研究表明清热生肌膏可保护Ⅱ度烧伤大鼠伤口愈合[13]。本研究结果显示，给予生肌膏治疗后，生肌膏治疗组大鼠肛周脓肿创面愈合率高于模型组(均P<0.05)，提示生肌膏对肛周脓肿创面愈合具有促进作用。Masson和HE染色结果显示，采用生肌膏治疗后，生肌膏治疗组大鼠创面组织中胶原形成情况和表皮生长速率均优于模型组，表明生肌膏有助于肛周脓肿术后创面中的胶原重塑和表皮生长，从而促进肛周脓肿术后的创面愈合。

Notch1信号通路是一类高度保守的信号途径，参与各种癌症的发生和发展[14-15]。近年来，越来越多研究证实，Notch1基因的激活可能与皮肤伤口愈合密切相关[16-18]。Na等[16]研究发现，Notch1在皮肤伤口边缘表达上调，其表达减少或失活均不利于皮肤伤口愈合；而激活Notch1途径或可通过促进角质形成细胞的增殖和迁移，从而促进皮肤伤口愈合[17]。此外，碱性成纤维生长因子可以通过上调Notch1蛋白表达，改善伤口愈合质量并减轻疤痕[18]。本研究结果显示，模型组大鼠的肛周脓肿术后创面组织Notch1蛋白及mRNA相对表达量均低于对照组(均P<0.05)，提示Notch1表达下调可能与大鼠肛周脓肿术后创面愈合不佳相关；而生肌膏治疗组大鼠的肛周脓肿创面组织Notch1蛋白及mRNA相对表达量均高于模型组，提示生肌膏可能通过激活Notch1信号通路，加速肛周脓肿大鼠术后伤口的愈合。

创面组织中的炎症反应对于对感染的发生具有重要影响，其会导致的伤口难以愈合或产生疤痕[19]。本研究结果显示，模型组大鼠的创面组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平均高于对照组(均P<0.05)，提示在肛周脓肿术后创面愈合过程中，创面愈合组织中存在炎症反应；而与模型组相比，生肌膏治疗组大鼠创面组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平均降低(均P<0.05)，提示生肌膏对肛周脓肿术后创面愈合的促进作用，可能与降低炎症因子表达有关。

综上所述，生肌膏可能通过激活Notch1信号通路、减轻创面的炎症反应，促进肛周脓肿术后创面的愈合。这表明生肌膏对肛周脓肿术后创面具有潜在的治疗价值，但临床肛周脓肿术后创面愈合受环境影响较大，且易被细菌感染，因此生肌膏对该疾病的治疗效果及作用机制有待更深入的研究以证实。