基于网络药理学探讨增液汤治疗糖尿病的作用机制▲

田 瑛 邓小敏 苏 冬 王振刚 方桂玉 毛发林

(1 广西中医药大学研究生院，南宁市 530001，电子邮箱:1244897242@qq.com；2 广西中医药大学第一附属医院内分泌科，南宁市 530023)

近年来，糖尿病已成为继癌症、心血管疾病之后的威胁人类健康的第三大疾病。相关流行病学调查显示，糖尿病患病率及致死率呈逐年上升趋势[1]；新近发布的国际糖尿病联盟2019全球糖尿病地图(第9版)显示，全球约4.63亿人罹患糖尿病，中国位居全球首位，患者数量达1.16亿[2]。目前尚无有效治愈糖尿病的方案，西药降糖临床效果好，但长期使用副作用大且易产生药物依赖，不能有效预防及控制并发症[3]。相关研究表明，中药治疗控制血糖有效，副作用少[4]，可有效预防及治疗糖尿病并发症[5]。增液汤(玄参、生地黄、麦冬)作为临床广泛应用的中药汤剂，前期已有实验表明其能降低糖尿病小鼠的血糖，并改善糖尿病小鼠的糖耐量[6]。但目前增液汤的降糖机制尚未明确，这限制了增液汤在国内外临床的广泛应用。而中药复方的多药物、多成分、多靶点特点与网络药理学的研究方法相契合，网络药理学为中药的系统研究提供了具体方法[7-8]。因此，本研究基于网络药理学方法分析增液汤治疗糖尿病的作用机制。

1 资料与方法

1.1 活性化合物的筛选 运用中药系统药理学数据库与分析平台(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)筛选增液汤3味中药(包括玄参、生地黄、麦冬)的活性化合物。筛选条件：生物利用度(oral bioavailability，OB)表示口服的药物到达血液循环所占口服剂量的比例，一般是决定生物活性分子类药性的关键指标，因而设置OB≥30%；具有较高的类药性(drug likeness，DL)的化合物才能在口服吸收过程中被安全送达靶器官发挥其生物学效应，因而设置DL≥0.18；剔除没有相关信息的化学成分。

1.2 活性化合物的靶点预测 通过中药系统药理学数据库收集增液汤活性化合物的作用靶点，使用 UniProt(http://www.uniprot.org/)数据库对所有靶点名称进行标准化校正。

1.3 糖尿病相关基因的筛选 使用GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)对糖尿病相关的基因进行筛选，汇总、去重后，将增液汤活性化合物的作用靶点网络映射到糖尿病相关靶点网络中，2个网络中重叠的基因即被认为是增液汤中药活性成分干预糖尿病的靶点。

1.4 可视化网络构建 将筛选出的增液汤活性成分及其靶点以及糖尿病的相关基因导入Cytoscape 3.6.1软件，构建增液汤“药物-活性成分-靶点-疾病”网络。网络图中“节点(node)”代表增液汤中的活性成分和作用靶点，“边(edge)”代表活性成分、作用靶点间的相互关系。并对可视化网络进行网络拓扑学分析，其中，靶点度值(Degree)和中介中心度是拓扑结构中两个重要的参数，可用于评价增液汤有效化合物、靶标的重要程度。度值和介数中心数越大，说明靶点越处于PPI网络中心，发挥关键作用。图中靶点圆越大，表明度值和介数中心数越大。

1.5 蛋白互作网络的构建 将增液汤活性成分作用靶点和糖尿病相关基因重叠的靶点上传至在线分析工具STRING(https://string-db.org/)，参数设置评分条件≥0.7(高等置信度)，隐藏图中游离的蛋白质，输出string_interactions.tsv文件，导入Cytoscape以增强其可读性，获取蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)信息，根据在string中设置的高等置信度的筛选条件明确PPI网络中的关键蛋白。

1.6 增液汤治疗糖尿病相关基因的功能分析和通路分析 利用在线分析工具DAVID(Version 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析，包括生物过程、细胞成分、分子功能，选择P<0.05的项目进行分析，采用GraphPad Prism 8.0软件将这些条目做成可视化条形图。利用DAVID平台进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析，将结果导入在线分析平台OmicShare(http://www.omicshare.com)，对增液汤治疗糖尿病相关基因的核心通路进行筛选及注释。

2 结 果

2.1 活性化合物筛选结果和靶点预测结果 最终获得243个活性化合物进行后续分析。243个活性化合物共得到212个作用靶点，与获得的251个糖尿病相关的基因进行映射，得到49个重叠靶点，见图1。

图1 增液汤活性成分作用靶点与糖尿病相关基因的共有靶点韦恩图

2.2 可视化网络和PPI网络图 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络见图2。根据药物-靶标相互作用预测的靶标预测算法给出的评分递减顺序对其预测的候选靶标进行排序。分数为%3E=“分数截止”的预测候选目标(包括由药物数据库、KEGG和TTD支持的已知直接目标)将被假设为查询化合物的潜在目标。建立增液汤中药药活性成分干预糖尿病的靶点的PPI网络图(见图3)，涉及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1、鼠双微粒体2(murine double minute 2,MDM2)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)等多个关键靶点。

图2 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络图

图3 PPI网络图

2.3 增液汤治疗糖尿病相关基因的GO分析结果 对增液汤治疗糖尿病的49个候选靶点进行GO富集分析。在满足FDR<0.01条件下，生物过程共有29条，包括细胞对外来刺激的反应、对活性氧的反应、氧化应激的细胞反应、神经元死亡的调节等；分子功能共有4条，包括薄膜筏、膜微域、膜区域等；细胞组分共有6条，包括泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、磷酸酶结合等。将排名靠前的3个条目绘制成条形图，见图4。

图4 GO分析结果(前3条)

2.4 增液汤治疗糖尿病相关基因的KEGG富集分析和核心通路筛选结果 共富集出58条信号通路，包括磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路和缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信号转导通路等，见图5、图6、图7。

图5 KEGG分析结果(根据FDR校正后得的P值进行排列，选前20条)

图6 PI3K-Akt信号转导通路

图7 HIF-1信号转导通路

3 讨 论

糖尿病属中医“消渴病”范畴，以多饮、多食、多尿、形体消瘦为主要特征。《诸病源候论》提到“五脏六腑，皆有津液。若脏腑因虚实而生热者，热气在内，则津液竭少，故渴也”。消渴形成的关键在于“津液竭”，津液敷布失常，引起津不上承烦渴多饮，津液直趋下行频数多尿，肌肤失润“消肌肤”而形体消瘦。增液汤首载于《温病条辨》，有增液润燥之效，可解消渴病之津伤液竭[9]，但其降糖的作用机制尚不明确。中药复方具有药味多，成分复杂，通过调整药量、炮制方法、配伍等多因素治疗疾病的特点。而网络药理学以“多成分-多靶点-多途径”为网络构建思想，与中药复方的特点不谋而合，为中药复方的研究提供了新方向[10-11]。

本研究基于网络药理学方法，共筛选出增液汤活性成分与相关基因的共同靶点49个，包括Akt1、MDM2等多个关键靶点。其中，Akt1参与多种生物学过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长、胰岛素信号传导和血管生成等[12]，其激活依赖于PI3K途径，并被认为是该途径的中心节点。麦冬皂苷为增液汤中麦冬的主要有效成分之一[13]，其可能是通过抑制Akt1及其下游蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)以增强心肌细胞的自噬能力，从而改善糖尿病大鼠的心脏功能[14]。p53作为肿瘤抑制因子，活化后通过参与糖代谢、脂肪酸代谢等途径而在代谢平衡调控中发挥重要作用。而MDM2癌基因是p53的负性调节因子[15]，其能通过抑制p53来抑制糖尿病肾病小鼠核因子红系2相关因子2的抗氧化活性，以达到预防糖尿病肾病的目的[16]，这提示激活MDM2和抑制p53或为防治糖尿病肾病的新方向。

我们进一步针对增液汤作用于糖尿病的49个作用靶点进行GO分析，发现作用靶点涉及细胞对外来刺激的反应、对活性氧的反应、氧化应激的细胞反应、神经元死亡的调节等生物过程，薄膜筏、膜微域、膜区域等细胞组分，泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、磷酸酶结合等分子功能。糖尿病是一种与营养过剩有关的疾病，是一种常见的代谢紊乱，通常先于代谢综合征发生，与胰岛素抵抗、血脂异常和高血压等相互关联[17]。代谢性炎症与各种细胞内应激有关，例如线粒体氧化应激、内质网应激、自噬缺陷[18]。而炎症也是糖尿病中的一个基本生物学过程。因此，适当调节这些机制对于防止初始炎症反应不受控制以及疾病发展至关重要[19]。

本研究中，KEGG分析富集出了58条信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、mTOR信号通路等，其中PI3K-Akt信号通路是2型糖尿病发生和发展的经典通路。Yang等[20]发现，利拉鲁肽改善糖尿病大鼠认知障碍的作用机制可能与激活丝裂原活化蛋白激酶和PI3K-Akt信号通路有关。师林等[21]通过检测存在胰岛素抵抗的脾虚痰湿型肥胖2型糖尿病大鼠的血脂、血糖水平及蛋白情况，发现该药方可能通过良性调节PI3K-Akt信号通路调节糖脂代谢，改善胰岛素抵抗。因此，我们推测增液汤可能主要通过激活其下游分子Akt1以调节PI3K-Akt信号通路，从而促进胰岛素的分泌、改善胰岛功能等过程，进而发挥对2型糖尿病的干预作用。

综上所述，增液汤治疗糖尿病具有多靶点、多通路作用的特点，其可能是通过激活下游分子Akt1，调节PI3K-Akt信号通路，促进胰岛素的分泌、改善胰岛功能等过程，对糖尿病进行干预。本研究利用多个数据库综合分析，所得结果有一定置信度，但中药复方的功效与其中各药物的产地、炮制方法、配伍、煎药方式、用药剂量等因素密切相关，中医遵从“因人、因时、因地”三因制宜的治疗方法，这使得中药复方起效的机制复杂化。本研究仅对增液汤本身的化合成分及作用靶点等进行分析，尚未涉及药物与人、时、地的相互作用，不能完全诠释中药复方的精髓所在。但采用网络药理学对中药复方进行化合物分析、作用靶点预测、信号通路富集等将提高中医药的国际认可度，更好地推动中医药走向世界。