基于网络药理学探究盆炎灵合剂治疗盆腔炎性疾病的作用机制

龚琳娜， 邹 威， 董雅倩， 方超英， 刘孟华*

(1.南方医科大学药学院，广东 广州 510515；2.湖南省妇幼保健院，长沙市妇产科中药制剂研发中心，湖南 长沙 410008)

盆腔炎性疾病是一组由病原菌引起的感染性和炎症性疾病，主要发生在女性生殖道上，病情严重时会对患者的健康生活和生命安全造成重大的威胁[1]。西医主要采用抗生素进行治疗，其对控制病原体效果明显，但对慢性炎症的作用效果不理想。

盆炎灵合剂是一种中药制剂，由湖南省妇幼保健院研制，其治疗慢性盆腔炎的临床疗效已得到证实。该制剂包括丹酚酸B、芍药苷、甘草苷、延胡索乙素、绿原酸、红景天苷、阿魏酸等有效成分[2]。其性状为黄棕色液体，味苦微甜，具有清热解毒、活血化瘀、理气止痛等功效，临床常用于治疗急慢性盆腔炎、附件炎、子宫内膜炎、慢性子宫颈炎、输卵管不通性不孕症以及月经不调等。其在临床上对慢性盆腔炎有良好的治疗效果[2]，已有实验证实盆炎灵合剂对盆腔炎大鼠具有抗炎作用，能显著抑制盆腔炎大鼠子宫炎症的发生发展[3]。但其治疗盆腔炎性疾病的药理作用机制尚不明确，因此本文采用网络药理学技术对盆炎灵合剂的药效物质基础及作用机制进行分析，希望为其临床合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物 盆炎灵合剂由湖南省妇幼保健院提供(湘药制字Z20070201，250 mL/瓶，批号20180726)。红景天苷(批号110818-201206)、去甲异波尔定(批号111825-201402)、绿原酸(批号110753-201314)、芍药苷(批号110736-201438)、阿魏酸(批号110773-201614)、甘草苷(批号111610-201106)、丹酚酸B(批号111562-201212)、藁本内酯(批号111737-201204)、甘草酸(批号110731-201116)、齐墩果酸(批号110709-201206)对照品均购自中国食品药品检定研究院；酪氨酸(批号0215868010)对照品均购自上海宝曼生物科技有限公司；精氨酸(货号B21920)、奎宁酸(货号B21879)，枸橼酸(货号B21313)、马钱苷酸(货号B20823)、对羟基苯丙酸(货号B20325)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇(批号1727207407)、乙腈(批号JA077330)为色谱纯，购自德国Merck公司；甲酸(批号F112034)为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 动物 10只SPF级9周龄SD雌性大鼠，体质量220～240 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2011-0003，质量合格证编号43004700011989，随机分为空白组、给药组，每组5只，禁食12 h，自由饮水，称定体质量，按每天10 mL/kg剂量分别灌胃给予纯化水、盆炎灵合剂，连续5 d，末次给药45 min后，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，15 min后心脏取血，迅速对含EDTA抗凝剂的血液离心(3 000 r/min)5 min，取血浆，置于-80 ℃冰箱中冷冻备用。

1.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，甲醇制成一定质量浓度的溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.4 血浆样品处理 将血浆置于4 ℃冰箱中解冻，取给药组5只大鼠血浆各100 μL，混匀，加入3倍体积的甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液，加入内标涡旋3 min后置于4 ℃冰箱中过夜，进行蛋白沉淀，13 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，滤液即为含药血浆供试品溶液。同法制备空白血浆供试品溶液。

1.5 血中移行成分分析 采用由Agilent 1290 LC系统和Agilent 6540 Q-TOF-MS系统组成的LC-Q-TOF-MS系统(美国安捷伦公司)，对含药血浆供试品、空白血浆供试品、对照品溶液进行分析。色谱条件为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)，流动相水(含0.1%甲酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.5 mL/min；柱温25 ℃；进样量5 μL。质谱条件为毛细管电压3 500 V；喷嘴电压(Expt)500 V；碎裂能量120 V；气体温度250 ℃；鞘气温度350 ℃；正负离子扫描，m/z50～1 250；干燥气、碰撞气氮气；碰撞能量20 V。

表1 梯度洗脱程序

1.6 蛋白靶点筛选 将盆炎灵合剂入血化合物的三维立体结构导入PharmMapper服务器，采用默认参数对上述药物分子的体内靶点进行预测，将反向分子对接获得的蛋白信息与DrugBank、TTD、HIT数据库中盆腔炎性疾病相关靶点进行对比和筛选，并利用UniProt数据库将最终得到的靶点名转换为其编码的基因名。

1.7 入血平移成分数据库构建 将盆炎灵合剂的入血成分和相关蛋白通过SYBYL-X7.3软件进行分子对接，以对接分值≥6.0作为活性化合物的筛选条件，筛选出具有较高活性的化合物。

1.8 化合物-靶点网络构建 将活性化合物及相关靶点导入Cytoscape3.7.1软件，构建化合物-靶点网络。

1.9 蛋白互作(PPI)网络构建 将相关靶基因上传至STRING11.0在线软件，获取蛋白相互作用信息，并将打分值>0.7的蛋白相互作用值视为高置信度数据，将蛋白相互作用数据导入Cytoscape3.7.1软件，构建PPI网络，并在Excel中对PPI网络中的蛋白绘制条形图。

1.10 基因本体(GO)功能富集分析 采用David v6.8数据库，对PPI网络中的蛋白进行GO生物学过程富集分析。

1.11 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 采用David v6.8数据库，对PPI网络中的蛋白进行KEGG通路富集分析。采用Cytoscape3.7.1软件，对KEGG通路富集分析中的信号通路构建靶点-通路网络。

2 结果

2.1 活性化合物筛选 通过SYBYL-X7.3软件将29种入血成分分别与121个蛋白进行分子对接，共筛选出分子对接分值≥6.0的27个化合物及110个相关蛋白，活性化合物提取离子流图见图1，基本信息见表2。

表2 活性化合物基本信息

图1 活性化合物在正离子(A)、负离子(B)模式下的提取离子流图

2.2 盆炎灵合剂化合物-靶点相互作用网络 化合物-靶点网络包含137个节点(27个化合物节点、110个靶点节点)和812条相互作用连线，见图2。由此可知，有66.67%的化合物作用靶点≥10个，≥50个的有7个，从化合物角度来看，Degree排名前5位的是SAB、SAA、GI、AR、RH；从靶点角度来看，Degree排名前4位的是白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK1)、Toll样受体8(TLR-8)、Tristetraprolin(TTP)、Rho激酶2(ROCK2)；化合物平均靶点数目为30.22个，每个靶点平均与7.33个化合物发生作用。

续表2

注：蓝色表示化合物，红色表示靶点。

2.3 盆炎灵合剂靶点PPI网络的构建与分析 PPI网络(图3)包含75个节点，411条边，其中节点表示蛋白，每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系；Degree≥20的节点包括Toll样受体4(TLR4)、信号传导及转录激活因子3(STAT3)、白细胞介素-6(IL-6)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT1)、趋化因子CXCL8(CXCL8)、信号传导及转录激活因子1(STAT1)、白细胞介素-4(IL4)、核转录因子-κB 1(NFκB1)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、髓样分化因子88(MYD88)，其中TLR4、STAT3和IL-6度值最大，分别能与34、33、30个蛋白发生相互作用。前30个关键蛋白质节点的Degree所绘制出的条形图见图4。

注：洋红色表示Degree≥30的蛋白，黄色表示20≤Degree<30的蛋白，绿宝石色表示10≤Degree<20的蛋白，深蓝色表示Degree<10的蛋白。

注：数字表示节点的Degree。

2.4 GO功能富集分析 根据错误发现率(FDR)<0.05，确定了123个GO条目(表3根据FDR列出前20个)，主要涉及对细胞坏死以及凋亡的调控、多细胞生物过程的调控、级联反应、有机物质的反应、分子功能的调控、系统过程的调控等方面，见表3。

表3 盆炎灵合剂PPI网络中的GO条目(FDR<0.05)

2.5 KEGG通路富集分析 共得到41条信号通路，以FDR<0.05为标准筛选出12条，包括Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、Fc epsilon RI信号通路和JAK-STAT信号通路(JAK-STAT signaling pathway)等，见表4、图5。

注：深青色表示蛋白靶点，红色表示信号通路ID。

表4 盆炎灵合剂PPI网络中的通路(FDR<0.05)

3 讨论

盆炎灵合剂作为治疗妇科炎症的中药制剂，在治疗湿热蕴结、湿热下注型盆腔炎性疾病方面具有显著疗效[3]。本研究以盆炎灵合剂的27个活性化合物为基础，构建了化合物-靶点网络，其中关键靶点包括IRAK1、TLR-8、TTP等。IRAK1通过参与Toll样受体和白细胞介素-1信号通路，调节先天免疫和炎症[4]。有研究表明，靶向IRAK1可抑制NF-κB通路[5]，而盆炎灵合剂中的成分PE对IRAK1-NF-κB通路具有抑制作用[6]，可见调控IRAK1的表达可以抑制炎症损伤[7]。TLR8主要对细胞的增殖、分化、转化和凋亡进行调节，同时还与炎症和肿瘤等疾病存在紧密联系[8-9]。激活TLR8后可介导炎症免疫，进而清除体内肿瘤细胞和受病毒感染的细胞[10]。TTP在分化、代谢、增殖、炎症、肿瘤发生和免疫等多种生理病理过程中发挥着重要作用[11-14]。TTP介导的NLRP3炎性激活的减少还可以减少慢性炎症疾病的发展，例如动脉粥样硬化、结肠炎和关节炎[15]。在PPI网络中，TLR4、STAT3和IL-6的Degree远高于其它蛋白，其中TLR4在炎症反应及癌症发展中扮演着重要的角色[16-19]，被认为是连接炎症与肿瘤微环境的重要枢纽[20]。通过抑制TLR4/NF-κB和TLR4/MAPK信号通路可以抑制炎症反应[21]。STAT3在细胞生长、分化、免疫功能、造血功能和肿瘤相关炎症中发挥重要作用[22-23]。STAT3的持续激活可促进肿瘤细胞增殖侵袭、血管增生、免疫抑制、诱导和维持癌前炎性微环境等病理过程的发生发展[24]。因此推测，盆炎灵合剂可能是通过对这些关键靶点进行调控，从而达到治疗目的。

GO功能富集分析发现，盆炎灵合剂在治疗疾病时主要涉及有机物质的反应、受体活性、细胞组分等方面，而在KEGG通路富集分析中，基因主要富集到了Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、Fc epsilon RI signaling pathway和Chemokine signaling pathway上。有研究发现SAB具有良好的抗炎活性，其免疫调节作用与抑制TLR4信号通路有关[25]。SA能够显著地抑制TXNIP的表达，进而降低NLRP3炎症小体的表达水平，从而通过NOD样受体信号通路中的TXNIP-NLRP3炎症小体途径减轻细胞氧化应激和细胞外基质的积累[26]。AR的抗炎作用与参与肥大细胞细胞因子表达的信号分子的活化水平降低有关，例如趋化因子信号通路中的Akt等[27]。由此推测，盆炎灵合剂可能通过作用于与炎症反应和免疫反应直接相关的通路，从而对炎症起到治疗作用。此外，在与细胞生长及内分泌系统相关的通路上也富集到了大量基因，说明盆炎灵合剂的治疗作用也与这些通路密切相关。

综上所述，本研究对盆炎灵合剂中入血成分与网络数据库中筛选出的疾病靶点进行分子对接分析及网络分析，为盆炎灵合剂治疗盆腔炎性疾病的作用机制提供了科学依据，下一步将开展细胞、动物实验，对上述结果进行验证。