骨龙胶囊对骨质疏松大鼠骨代谢及骨量的影响

胡继兵， 邓馨悦， 张英驰， 李文凯*

(1.湖北省红安县人民医院，湖北 黄冈 438400；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北 武汉 430030)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是一种退变性疾患，以骨量丢失、骨代谢加快和易发生骨折为特点[1-2]。PMOP及其相关骨折逐渐成为一个严重的公共健康问题和沉重的社会负担。2015 年中国大陆地区40岁以上人群骨质疏松症发病率为24.62%，约1.4亿患病人群[3]。按骨质疏松症的临床表现，中医学中相近的病症有“骨痿”、“骨痹”等，以补肾益精、健脾益气、活血祛瘀为主要治疗方法[4-5]。骨龙胶囊含狗腿骨及穿山龙，主用于骨与关节风寒痹阻、肝肾不足者，有散寒镇痛、活血祛风及强筋壮骨作用[6]，但尚未见骨龙胶囊治疗PMOP的相关文献报道。本研究拟通过建立去卵巢大鼠骨质疏松模型，评价骨龙胶囊对骨质疏松大鼠骨代谢及骨量的影响，为指导临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 骨龙胶囊(山东东阿阿胶股份有限公司，批号1911004)，生理盐水制成0.1 g/mL灌胃液；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，生产批号499A)。骨钙素(BGP)检测试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒及血钙、磷检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；肝素、4%多聚甲醛、2%戊巴比妥钠(武汉博士德生物工程有限公司)。MicroCT(vivaCT 40，瑞士Scanco公司)。

1.2 分组、造模及给药 48只清洁级2月龄雌性SD大鼠，体质量(170±21)g，由华中科技大学同济医学院实验中心提供及饲养，实验动物生产许可证号SCXK(鄂)2008-0005，适应性喂养1周后，随机分为假手术组，卵巢切除(Ovariectomize, OVX，卵巢切除后大鼠体内雌激素模拟人绝经后骨质疏松)组，阳性对照组(OVX+戊酸雌二醇)，低、中、高剂量骨龙胶囊组(OVX+骨龙胶囊)，每组8只，骨质疏松造模方法同文献[7]，假手术组不切除卵巢，仅切除少量腹腔内脂肪后关腹。手术后2周大鼠开始灌胃给药，持续8周，其中阳性对照组按每天灌服0.09 mg/kg戊酸雌二醇，低、中、高剂量骨龙胶囊组分别每天灌服0.54、0.81、1.08 g/kg骨龙胶囊[骨龙胶囊用于人的最低临床用量为每天6 g，按照人与大鼠的体表面积换算法(6 g×0.018×5=0.54 g/kg)作为低剂量，取低剂量的2倍作为高剂量，高、低剂量的中间值作为中剂量]，假手术组、OVX组每天灌服等体积生理盐水，灌胃满8周后禁食12 h，称定质量，处死全部大鼠，取心脏动脉血，并留取右侧完整股骨标本，4%多聚甲醛固定。

1.3 血清Ca、P、BGP、ALP水平检测 大鼠心脏取动脉血5 mL，置于含有肝素的抗凝管中，4 ℃、2 000 r/min 离心10 min，取上清液，放置在-80 ℃冰箱中备用，检测血清Ca、P、BGP、ALP水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 MicroCT检测 使用Scanco vivaCT 40扫描及分析所有大鼠右侧股骨标本，具体方法同文献[8]，在70 kV、113 mA下使用10.5 μm层厚连续扫描股骨全长。在区分骨质和软组织时，骨小梁和骨皮质的阈值分别设定为180、220。骨小梁的感兴趣区域(ROI)选取从股骨远端生长板最低点以上10个层面开始，向上连续选择10个层面(105 μm)的范围，骨皮质的感兴趣区域(ROI)选取从股骨干中点向下50个层面(525 μm)的范围，前者测量参数包括骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁数量(TB.N)、骨小梁厚度(TB.Th)、骨小梁分离指数(TB.Sp)，后者测量参数包括骨皮质厚度(Ct. Th)、骨皮质相对面积(Ct.Ar/Tt.Ar)。

2 结果

2.1 体质量 48只大鼠术后切口均在1周后愈合，实验期间无死亡。与假手术组比较，OVX组和低、中、高剂量骨龙胶囊组大鼠体质量均升高(P<0.05)；与OVX组比较，阳性对照组大鼠体质量降低(P<0.05)，低、中、高剂量骨龙胶囊组之间无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量比较

2.2 骨龙胶囊对卵巢切除大鼠血清中Ca、P、ALP及BGP水平的影响 与假手术组比较，OVX组大鼠血清Ca、P增加(P<0.05)、ALP、BGP减少(P<0.05)；与OVX组比较，低、中、高剂量骨龙胶囊组大鼠血清Ca、P减少(P<0.05)、ALP、BGP增加(P<0.05)，但低、中、高剂量组之间无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清中Ca、P、ALP、BGP水平

2.3 骨龙胶囊对骨质疏松大鼠骨小梁骨量的影响 与假手术组比较，OVX组大鼠骨小梁骨量降低(P<0.05)；与OVX组比较，低、中、高剂量骨龙胶囊组骨小梁骨量升高(P<0.05)，但低、中、高剂量骨龙胶囊组之间无明显差异(P>0.05)。见图1。

注：A为假手术组，B为OVX组，C为阳性对照组，D为低剂量骨龙胶囊组，E为中剂量骨龙胶囊组，F为高剂量骨龙胶囊组，G为BV/TV(骨小梁相对体积)，H为Tb.Th(骨小梁厚度)，I为Th.N(骨小梁数目)，J为Tb.Sp(骨小梁分离指数)。与假手术组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05。

2.4 骨龙胶囊对骨质疏松大鼠骨皮质骨量的影响 与假手术组比较，OVX组大鼠骨皮质骨量降低(P<0.05)；与OVX组比较，低、中、高剂量骨龙胶囊组大鼠之间骨皮质骨量无明显差异(P>0.05)。见图2。

注：A为假手术组，B为OVX组，C为阳性对照组，D为低剂量骨龙胶囊组，E为中剂量骨龙胶囊组，F为高剂量骨龙胶囊组，G为Ct.Th(骨皮质厚度)，H为Ct.Ar/Tt.Ar(骨皮质相对面积)。与假手术组比较，*P<0.05。

3 讨论

近年来许多研究者从分子生物学水平研究中医药治疗骨质疏松症并取得了显著的进展，大量的基础及临床研究证实中医药在治疗骨质疏松方面有着独特的优势[9]。骨龙胶囊主用于骨与关节风寒痹阻、肝肾不足者，有散寒镇痛、活血祛风及强筋壮骨作用。唐晓颇等[10]研究发现骨龙胶囊在改善膝骨性关节炎的疼痛及功能评分方面疗效优于维固力胶囊，是一种治疗膝骨关节炎有效、安全的治疗药物。贾玉民等[11]研究发现骨龙胶囊能有效抑制类风湿性关节炎大鼠血清IL-1β和TNF-α炎性细胞因子的活性，对类风湿性关节炎有良好的治疗作用。刘海等[12]研究发现骨龙胶囊联合甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶治疗类风湿性关节炎并发骨质疏松能够有效促进骨形成及抑制骨吸收，增加骨密度，疗效显著优于单纯西药治疗。本研究发现骨龙胶囊可以降低骨质疏松大鼠血清中Ca和P的水平、增加血清中ALP和BGP的水平、增加股骨骨小梁的骨量，说明骨龙胶囊有良好的抗骨质疏松作用，这为进一步指导临床用药提供了实验依据。

骨骼的完整性由不断重复、时空偶联的骨吸收和骨形成过程维持，此过程称为“骨重建”。骨吸收过程与破骨细胞联系紧密，若破骨细胞骨吸收增强，可引起骨中Ca、P的流失，表现为骨量减少，血清Ca、P水平的升高[4]。而骨形成过程与成骨细胞的功能状态较密切， BGP和ALP是常用的成骨细胞功能检测指标。BGP是由成骨细胞分泌的一种特异性非胶原骨基质蛋白，ALP是成骨细胞的一种胞外酶，主要为骨的钙化提供磷酸，骨型占50%[7-13]。本研究结果显示与假手术组比较，OVX组大鼠血清Ca和P增加，血清BGP、ALP及股骨骨小梁骨量明显减少，说明本实验中去卵巢骨质疏松大鼠造模成功。此外，本研究还发现与OVX组比较，低、中、高剂量骨龙胶囊组血清Ca和P减少、血清ALP、BGP及股骨骨小梁骨量增加，这说明骨龙胶囊可以有效地促进骨质疏松大鼠的骨形成、减少破骨细胞引起的骨吸收。但同时还发现，本实验设立的3个不同剂量骨龙胶囊组间的骨代谢指标差异无统计学意义，这说明骨龙胶囊治疗骨质疏松不存在剂量依赖性。

此外，本实验中，低、中、高剂量骨龙胶囊组虽能使骨质疏松大鼠的骨代谢和骨量得到一定恢复和改善，但与假手术组比较仍有差异。本研究还发现OVX组与低、中、高剂量骨龙胶囊组间的股骨骨皮质参数没有明显差异，以上结果表明单独使用骨龙胶囊不足以治疗卵巢切除引起骨质疏松症。研究发现骨质疏松症如同其他慢性疾病一样，不仅要长期、个体化治疗，也需药物联合或序贯治疗[14]。因此，不建议单独使用骨龙胶囊治疗PMOP，而是联合钙剂、维生素D及其他骨吸收抑制剂或骨形成促进剂联合使用[2, 15-16]。

本研究仍有一些局限性：首先，本研究中实验对象是大鼠，实验数据及结论可能并不完全适用于人类。在确定药物安全的基础上，下一步还需要进行多中心、随机、对照、前瞻性临床实验来确定骨龙胶囊对人类骨质疏松的治疗效果。其次，骨龙胶囊作为一种复方中药制剂，单味药可能仅作用于机体某些环节而中药复方对机体具有全身性调节、作用于多环节和多通路，但具体机制还需进一步研究。