山楂叶总黄酮对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞增殖和迁移的影响和机制

何玉清， 亢泽峰， 李 凌， 关瑞娟

(1.青海省人民医院眼科，青海 西宁 810007；2.中国中医科学院眼科医院眼科，北京 100040)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的一种微血管并发症，更是导致视力下降的主要原因[1]。视网膜微血管内皮细胞(HRCEC)是血-视网膜内屏障的重要组分，高糖刺激可促进HRCEC增殖和迁移，进而促进新血管形成，导致出血、牵拉性视网膜脱离，最终造成视力丧失[2-3]。因此，降低高糖刺激下HRCEC的增殖和迁移能力有望成为DR治疗的新方向。山楂叶总黄酮是从山楂树叶子中提取的黄酮类化合物的总称，能有效降低2型糖尿病大鼠血糖，提高机体抗氧化能力，减轻氧化应激损伤[4]，它通过抑制糖尿病大鼠视网膜神经胶质细胞muller激活，提高谷氨酰胺合成酶活性，对糖尿病眼病防治意义重大[5]。基于上述研究，本研究旨在探讨山楂叶总黄酮对高糖诱导的HRCEC增殖和迁移的影响及其潜在机制。

1 材料

1.1 细胞 视网膜微血管内皮细胞(HRCEC)，购于美国模式培养物保藏中心。

1.2 试剂与药物 DMEM培养液(批号907039)、胎牛血清(批号10270-106)购自美国Gibco公司；青链霉素双抗溶液(批号P1400)购自北京索莱宝生物科技有限公司。山楂叶总黄酮(含量≥95%，批号20140213)购于晋城中晋药业有限公司。VEGF小干扰RNA(si-VEGF)及其阴性对照(si-NC)、PCR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；逆转录试剂盒(批号RR047A)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(批号RR820A)购自宝生物工程(大连)有限公司；噻唑蓝(MTT)(批号C0009)、兔源Ki67抗体(AF1738)、兔源上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)抗体(AF6759)、兔源神经钙黏素(N-cadherin)抗体(AF0243)、兔源磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(AF1186)、山羊抗兔IgG(A0208)购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 仪器 MK3型酶标仪，购自美国Thermo公司；iQ5型实时荧光定量PCR仪，购自美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 细胞培养 HRCEC采用含10%胎牛血清、5%青链霉素双抗的DMEM高糖培养液于37 ℃、含5% CO2的恒温细胞培养箱中培养，按照1∶2比例传代，每隔2 d换液1次，取对数期HRCEC进行实验。

2.2 细胞分组和处理 细胞分为对照组，模型组，山楂叶总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组，其中对照组、模型组分别用含25、90 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液处理细胞5 d；山楂叶总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液处理细胞4 d后，分别加入125、250、500 ng/mL山楂叶总黄酮培养液处理24 h。

本实验将山楂叶总黄酮高剂量+si-NC组为转染si-NC后，用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液处理细胞4 d，加入500 ng/mL的山楂叶总黄酮的培养液处理24 h；山楂叶总黄酮高剂量+si-VEGF组为转染si-VEGF后，用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液处理细胞4 d，加入500 ng/mL山楂叶总黄酮的培养液处理24 h。

2.3 MTT法检测细胞活力 细胞按“2.2”项下方法分组和处理后，取3×103个接种到96孔板，培养24 h后每孔添加20 μL MTT试剂，置于培养箱中孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亚砜，低速摇床振荡10 min至结晶完全溶解，酶标仪检测490 nm处各孔光密度(OD)值。

2.4 集落形成实验检测克隆形成能力 细胞按“2.2”项下方法分组和处理后，制备单细胞悬液，取200个(5 mL)接种到直径为60 mm的培养皿中，轻轻晃动培养皿式细胞分散均匀，置于细胞培养箱中培养2周，当培养皿中出现肉眼可见克隆时终止培养，弃去培养液，甲醇固定15 min，吉姆萨染色10 min，显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。

2.5 Transwell法检测细胞迁移能力 细胞按“2.2”项下方法分组和处理后，用无血清培养基制备单细胞悬液，取2 000个(200 μL)接种到Transwell上室，取500 μL含10%胎牛血清的培养基加到24孔板下室，置于细胞培养箱中培养24 h，棉拭子擦去未穿膜细胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，显微镜下随机选择5个视野进行细胞计数，以平均值表示迁移细胞数量。

2.6 蛋白质印记检测Ki67、E-cadherin、N-cadherin表达 细胞按“2.2”项下方法分组和处理后，RIPA裂解提取总蛋白，测定浓度，取30 μg作聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照湿法转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、避光显影、灰度分析步骤进行操作，以目的蛋白和GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表达。

2.7 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达 细胞按“2.2”项下方法分组和处理后，Trizol试剂提取总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，利用SYBR Green master mix进行qPCR，以GAPDH为内参，2-ΔΔCT法检测VEGFmRNA表达。VEGF正向引物5′-AGACCCTCTCCACCAACCAGT-3′，VEGF反向引物5′-TACGACTCGCGTCAACCG-3′；GAPDH正向引物5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′，GAPDH反向引物5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′。

3 结果

3.1 山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC增殖的影响 与对照组比较，模型组HRCEC细胞活力、克隆数、Ki67蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，山楂叶总黄酮低、中、高剂量组HRCEC细胞活力、克隆数、Ki67蛋白表达降低(P<0.05)；与山楂叶总黄酮低剂量组比较，山楂叶总黄酮中剂量组HRCEC细胞活力、克隆数、Ki67蛋白表达降低(P<0.05)；与山楂叶总黄酮中剂量组比较，山楂叶总黄酮高剂量组HRCEC细胞活力、克隆数、Ki67蛋白表达降低(P<0.05)。见图1～2、表1。

图1 各组HRCEC克隆形成数

图2 各组Ki67蛋白表达

表1 山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC增殖的影响

3.2 山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC迁移的影响 与对照组比较，模型组HRCEC迁移数、N-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，山楂叶总黄酮低、中、高剂量组HRCEC迁移数、N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)；与山楂叶总黄酮低剂量组比较，山楂叶总黄酮中剂量组HRCEC迁移数、N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)；与山楂叶总黄酮中剂量组比较，山楂叶总黄酮高剂量组HRCEC迁移数、N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。见图3～4、表2。

图3 各组HRCEC迁移细胞数

图4 各组E-cadherin、N-cadherin蛋白表达

表2 山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC迁移的影响

3.3 山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC中VEGF表达的影响 与对照组比较，模型组HRCEC中VEGFmRNA表达升高(P<0.05)；与模型组比较，山楂叶总黄酮低、中、高剂量组HRCEC中VEGFmRNA表达降低(P<0.05)；与山楂叶总黄酮低剂量组比较，山楂叶总黄酮中剂量组HRCEC中VEGFmRNA表达降低(P<0.05)；与山楂叶总黄酮中剂量组比较，山楂叶总黄酮高剂量组HRCEC中VEGFmRNA表达降低(P<0.05)。见表3。

表3 山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC中VEGF表达的影响

3.4 干扰VEGF增强山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC增殖的影响 与山楂叶总黄酮高剂量+si-NC组比较，山楂叶总黄酮高剂量+si-VEGF组HRCEC中VEGFmRNA表达、细胞活力、克隆数、Ki67蛋白表达降低(P<0.05)。见图5～6、表4。

图5 加入干扰VEGF后各组HRCEC克隆数

图6 加入干扰VEGF后各组Ki67蛋白表达

表4 干扰VEGF增强山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC增殖的影响

3.5 干扰VEGF增强山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC迁移的影响 与山楂叶总黄酮高剂量+si-NC组比较，山楂叶总黄酮高剂量+si-VEGF组HRCEC迁移细胞数、N-cadherin蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。见图7～8、表5。

表5 干扰VEGF增强山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC迁移的影响

图7 加入干扰VEGF后各组HRCEC迁移细胞数

4 讨论

图8 加入干扰VEGF后各组E-cadherin、N-cadherin蛋白表达

研究显示，山楂叶总黄酮通过改善抗氧化酶活性，提高机体清除自由基能力，降低氧化应激损伤，对糖尿病大鼠脑损伤、肝损伤、胰腺组织损伤具有保护作用[6-8]，还可降低胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及黏附能力[9]。Ki67是一种细胞增殖相关核抗原，与细胞的有丝分裂密切相关，其表达是反应细胞增殖能力和活跃程度的重要指标[10]。E-cadherin和N-cadherin是钙离子依赖的细胞粘附素家族成员，对维持细胞极性和完整性具有重要作用，E-cadherin表达缺失、N-cadherin表达增加可促进细胞侵袭转移[11]。本研究显示，高糖刺激后HRCEC中Ki67和E-cadherin蛋白表达、细胞活力、克隆形成数、迁移细胞数明显升高，N-cadherin蛋白表达显著降低，而山楂叶总黄酮呈剂量依赖性地降低HRCEC活力、克隆形成和迁移能力，促进Ki67和E-cadherin蛋白表达，提示山楂叶总黄酮可抑制高糖诱导的HRCEC的增殖、迁移和侵袭。

VEGF一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，其通过与内皮细胞膜上VEGF受体结合，激活下游丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路，诱导内皮细胞生长和血管增生[12]。研究显示，DR患者视网膜组织中VEGF高表达与视网膜新生血管形成密切相关，抑制VEGF表达可诱导HRCEC细胞周期阻滞，发挥抗增殖作用[13-14]。此外，抑制瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)对高糖诱导的HRCEC增殖、迁移和管腔形成的阻碍作用可能与抑制VEGF表达有关[3]。本研究显示，高糖刺激后HRCEC中VEGFmRNA表达明显升高，而山楂叶总黄酮呈剂量依赖性地抑制高糖诱导的VEGFmRNA表达，干扰VEGF表达可增强山楂叶总黄酮对高糖处理的HRCEC增殖、迁移的抑制作用。

综上所述，山楂叶总黄酮可通过下调VEGF表达抑制高糖诱导的HRCEC增殖和迁移，能为关于该成分防治DR的研究奠定理论基础。