山楂、决明子、泽泻提取物对高脂血症大鼠血脂水平、肝功能及HMGCR表达的影响

胡慧明， 朱彦陈， 于城安， 袁 斌， 陈笑天， 官 扬， 邓雅琼， 邵 峰*

(1.江西中医药大学科技学院，江西 南昌 330004；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004)

高脂血症又称为血脂异常，是一种中老年人最常见的全身性疾病，它是诱发脂肪肝、肥胖、高黏血症、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、冠心病及脑卒中等心脑血管疾病的重要危险因素[1-3]。近年来，调脂中药受到了广泛的认可与青睐，其特点在于食用安全，作用多途径、多靶点，药效温和，适于长期服用。

临床上高脂血症主要采用益气健脾、疏肝理气、补益肝肾等方法治疗[4]，肝主疏泄，气机调畅，有助于脾的运化和升清，是瘀血形成的重要环节；脾主运化升清，又有助于肝的疏泄升发，为“生痰之源”；肾主水化气，为先天之本，对五脏的功能具有调节作用，调节主持全身水液输布[5]，若脾失运化、肝失疏泄、肾失气化，则气血运行不畅，津液内停，化生膏脂，故应从肝、脾、肾辨证入手，通过健脾化痰、祛瘀、滋补肝肾以调脂[6-7]，可更好地提高临床疗效。

决明子具有清肝明目、滋益肝肾之功效，山楂能健脾开胃、行气散瘀，泽泻又可利水渗湿、泄热通淋，正是从肝脾肾角度论治，均对高血脂症有明显的疗效[8-10]，临床应用广泛，但三药合用的调脂保肝作用及机制尚未见报道。因此，本实验采用高脂饲料喂养大鼠模拟人类不良饮食习惯建立高脂血症模型，考察山楂、决明子、泽泻提取物对大鼠血脂水平、肝功能及HMGCR表达的影响，并探讨其潜在作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠40只，体质量180～220 g，购于江西中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(赣)2018-0003。饲养条件为温度22～26 ℃，相对湿度60%～70%，每日更换水和饲料。

1.2 试剂与药物 山楂提取物(粉末状，标准水提工艺，即药材粉碎→投料→水浸泡→提取→浓缩→喷雾干燥→灭菌→过筛→粉末)(批号 ZLSC19010401)、决明子提取物(粉末状，标准水提工艺，操作同山楂提取物)(批号ZLSC18121003)、泽泻提取物(粉末状，标准水提工艺，操作同山楂提取物)(批号ZLSC18101305)均购自南京泽朗生物科技有限公司。辛伐他汀片，购自天津怀仁制药有限公司(批号20180605)。高脂饲料(猪油10%、胆固醇2%、三号胆盐1%、蛋黄粉10%)，购自南通特洛菲饲料科技有限公司(批号19040106)。总胆固醇(TC)试剂盒(批号 2019011501)、甘油三酯(TG)试剂盒(批号 2018091801)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒(批号 2018091901)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(批号2018082701)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(批号 2018121103)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(批号 2018111401)，均购自安徽伊普诺康生物科技股份有限公司；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)抗体，购自南京恩晶生物科技有限公司(批号 H15F07)。

1.3 仪器 AU480全自动生化分析仪(美国Beckman Coulter公司)；Dako CoverStainer组织染色机(丹麦Dako Denmark A/S公司)；HI1210摊片机、DM1000生物显微镜(德国Leica公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

2 方法

2.1 药物制备 将3种提取物按1∶1∶1比例混合，蒸馏水分别配制成0.1、0.3 g/mL混悬液；辛伐他汀片给药前，蒸馏水配制成1 mg/mL混悬液。

2.2 分组、造模及给药 将40只大鼠随机分为正常对照组，模型对照组[根据2015年版《中国药典》3味药材的成人推荐剂量(每天9 g)进行动物给药剂量换算(成人按照60 kg计算，折算成大鼠剂量约为1 g/kg)]，山楂、决明子、泽泻提取物低剂量组(1 g/kg)，山楂、决明子、泽泻提取物高剂量组(3 g/kg)，阳性对照组(辛伐他汀，10 mg/kg)，每组8只，正常对照组大鼠给予基础饲料，其他各组大鼠给予高脂饲料[11]，实验期间自由采食饮水，连续5周。同时，各组大鼠每天灌胃给予相应药物，容量1 mL/100 g，每天1次，连续5周，正常对照组、模型对照组大鼠灌胃给予相应体积的蒸馏水。

2.3 标本采集、指标检测 分别于造模给药2、5周后，各组大鼠眼眶取血0.8 mL，3 500 r/min离心10 min，取血清，全自动生化仪检测TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平。

2.4 肝脏病理形态学观察 末次给药采血完毕后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)麻醉，解剖取肝脏，甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，HE染色，中性树胶封片，在显微镜下观察病理变化，每张病理切片取3个视野进行评分[12-13]，其中肝细胞形态整齐，肝细胞索排列整齐，肝窦清晰，无脂肪变性，无炎症细胞浸润等病理改变，为0分；肝细胞索排列紊乱，偶见脂滴空泡，有轻微的炎性浸润，为1分；肝细胞有轻度肿胀，较多脂滴空泡和炎性浸润，为2分；肝窦消失，肝细胞重度肿胀，有大量脂滴空泡和炎性浸润，为3分。

2.5 肝组织HMGCR检测 采用免疫组化法，在光学显微镜下观察拍照，应用Image-Pro Plus6.0图像分析软件，根据染色面积和强度进行半定量分析，HMGCR平均光密度值=积分光密度(IOD)/面积(Area)。

3 结果

3.1 山楂、决明子、泽泻提取物对大鼠血脂水平的影响 与正常对照组比较，高脂饲料喂养2、5周后，模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01)，HDL-C水平降低(P<0.01)；与模型对照组比较，给药2、5周后，山楂、决明子、泽泻提取物1 g/kg剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05,P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)；3 g/kg剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)；辛伐他汀组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)。见图1～2。

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，**P<0.01。

3.2 山楂、决明子、泽泻提取物对大鼠血清ALT、AST水平的影响 与正常对照组比较，高脂饲料喂养2、5周后，模型对照组大鼠血清ALT、AST水平升高(P<0.01)；与模型对照组比较，给药2、5周后，山楂、决明子、泽泻提取物1 g/kg剂量组大鼠血清ALT、AST水平降低(P<0.05,P<0.01)；3 g/kg剂量组大鼠血清ALT、AST水平降低(P<0.01)；辛伐他汀组大鼠血清ALT、AST有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 肝组织病理形态学变化 正常对照组大鼠肝组织形态学正常，肝细胞分界清楚，汇管区完整清晰，肝细胞排列紧密整齐，肝窦清晰可见，肝细胞索呈放射状排列，肝细胞多边形，肝细胞未见变性；模型对照组大鼠正常肝组织结构消失，肝小叶结构破坏，细胞索排列紊乱，大部分肝窦消失，脂滴空泡较多，肝细胞重度肿胀，出现弥漫性肝细胞气球样变，大量炎性细胞浸润；山楂、决明子、泽泻提取物组大鼠肝组织气球样变、肿胀程度减轻，部分肝窦清晰可见，细胞内汇管区炎细胞浸润减轻，范围明显减小、辛伐他汀给药组大鼠脂滴空泡减少，肝组织气球样变、肿胀程度减轻，肝细胞内汇管区偶见部分炎性细胞浸润。见表1、图4。

表1 山楂、决明子、泽泻提取物对大鼠肝脏病理评分的影响

图4 各组大鼠肝组织形态学(HE，×200)

3.4 山楂、决明子、泽泻提取物对大鼠肝组织HMGCR表达的影响 正常对照组大鼠偶见肝细胞胞浆褐色阳性表达；模型对照组大鼠多数肝细胞胞浆棕褐色阳性表达；山楂、决明子、泽泻提取物1 g/kg剂量组大鼠部分肝细胞胞浆淡褐色阳性表达；3 g/kg剂量组、辛伐他汀组大鼠少数肝细胞胞浆淡褐色阳性表达。与正常对照组比较，模型对照组大鼠HMGCR阳性表达升高(P<0.01)；与模型对照组比较，各用药组HMGCR阳性表达下降(P<0.01)。见表2、图5。

表2 山楂、决明子、泽泻提取物对大鼠肝组织HMGCR表达的影响

图5 各组大鼠肝组织HMGCR表达(免疫组化，×200)

4 讨论

高脂血症是指血液中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)增高，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[14]，该病临床表现为高胆固醇血症，高甘油三脂血症或两者兼有(混合型高脂血症)。

中医认为，高脂血症乃因肝脾肾三脏功能失调[4]，病机主要是由于脾肾虚损，肝失疏泄，从而导致全身气机升降失常，水液代谢障碍，致使气滞血瘀，痰浊内生、浊阴不用，化为膏脂，进而导致高脂血症的产生[15]。山楂、决明子、泽泻提取物中山楂具有健脾开胃、行气散瘀之功效，决明子能清肝明目、滋益肝肾，泽泻具有利水渗湿、泄热通淋之功效，三者合用，整体调节，共奏肝脾肾三脏同治之效。本研究结果显示，山楂、决明子、泽泻提取物能改善高脂血症模型大鼠血脂水平，降低血清TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平；同时还能降低ALT、AST水平，并减轻肝组织气球样变、肿胀程度，改善炎症细胞浸润。提示其具有一定的调脂保肝作用。

体内获得胆固醇的两条途径是肝脏胆固醇的内源性自身合成以及小肠从食物中的吸收，其中肝脏合成的胆固醇是机体胆固醇最主要的来源。HMGCR是肝脏合成胆固醇的限速酶[16-17]，HMGCR表达上调则体内胆固醇合成增多，临床上他汀类药物是通过抑制HMGCR活性来产生降血脂作用的[18]。因此，抑制HMGCR则能减少体内胆固醇的合成，从而调节血脂代谢。本研究结果显示，与模型对照组比较，山楂、决明子、泽泻提取物不同剂量组大鼠肝组织HMGCR表达明显下调，提示其可能是山楂、决明子、泽泻提取物产生调血脂作用的重要靶点。

综上所述，山楂、决明子、泽泻提取物从肝脾肾同治角度能降低高脂血症模型大鼠血脂水平，改善肝功能，减轻肝脏脂肪变性，其作用机制可能是与下调HMGCR表达有关，但也可能存在其他作用靶点，有待进一步研究。同时三药合用在临床选药与用药剂量方面也起到了一定的指导作用，将为临床防治高脂血症提供客观依据和新思路。