基于多元统计分析和网络药理学预测延胡索醋制前后潜在质量标志物

贾宇然， 余伯阳， 李任时

(中国药科大学中药学院中药可追溯与标准化研究中心，江苏 南京 211198)

延胡索为罂粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎，始载于《雷公炮炙论》，有活血散瘀、利气止痛的功能，主治心腹腰膝疼痛、跌打损伤、瘀血作痛、月经不调等症，是一味传统的止痛中药[1]，其主要成分是生物碱，包括叔胺碱，季铵碱，碱性酚胺生物碱等，还含有少量树脂、黏液质、挥发油等[2-3]。目前，延胡索临床应用以醋制品为多，其所含游离生物碱与醋酸结合后生成易溶于水的醋酸盐，同时炮制后饮片质地变软，提高了生物碱类成分的提取率。现代研究表明，醋性味酸、苦、温，具有引药入肝、散瘀止痛活性，醋制后可增强舒肝止痛作用[4-5]。

目前，关于生、醋延胡索质量控制方法主要有2种，一是基于《中国药典》延胡索质控指标——延胡索乙素，二是结合近红外光谱[6]、HPLC指纹图谱[7-9]，但前者不能全面控制药材质量，后者并未系统研究药材醋制前后化学成分与药效、药性改变的关联。基于中药质量控制研究困境，刘昌孝院士提出中药质量标志物(Q-marker)的概念，结合天然化学、分析化学、化学计量学、药理学、系统生物学等学科，构建更科学的质量控制理论[10-12]。

本研究将HPLC与多元统计分析相结合，筛选、鉴定延胡索醋制前后的特征差异性成分，预测潜在质量标志物，探究其变化规律。再通过网络药理学分析潜在质量标志物与镇痛作用相关靶点和通路，从而验证其用于质量控制合理性，以期为相关质量控制研究提供理论依据。

1 材料

1.1 药材与试剂 药材信息见表1，经中国药科大学余伯阳教授鉴定为罂粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎，标本保存于中国药科大学中药可追溯与标准化中心。磷酸、三乙胺、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、冰乙酸(色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙腈(色谱级，德国默克公司)；甲醇(色谱级，上海星可高纯溶剂有限公司)；氨水(分析级，南京化学试剂股份有限公司)；龙门米醋(食品级，北京二商龙和食品有限公司)。对照品延胡索乙素(18050203，纯度≥98%，成都普非德生物技术有限公司)；延胡索甲素(19042601，纯度≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司)；去氢紫堇碱(18111303，纯度≥98%，成都普非德生物技术有限公司)；海罂粟碱(19042412，纯度≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司)。醋延胡索均由生品经醋制得到，编号CS1～CS21。

表1 样品信息

1.2 仪器 Agilent InfinityⅡ Prime 1260仪、InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱(2.1 mm×150 mm，2.7 μm，美国安捷伦公司)；JYH-B40Q1小型煎药壶(小熊电器股份有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国密理博公司)；TOKIT智能热敏炉炒锅(上海纯米电子科技有限公司)；BM-1200电子天平(启东友铭衡器有限公司)。

2 方法

2.1 生、醋延胡索特征差异成分分析

2.1.1 生、醋延胡索制备

2.1.1.1 生延胡索 去除杂质，切片备用。

2.1.1.2 醋延胡索 净延胡索，加20%醋拌匀，闷透，置炒制容器内，炒干，取出，放凉，切片备用[13]。

2.1.2 供试品溶液制备 称取延胡索、醋延胡索饮片各100 g，加水700 mL，浸泡30 min，煮沸后继续煎煮30 min，200目筛趁热过滤；再加入600 mL水，煮沸后继续煎煮20 min，同法过滤，合并滤液。滤液减压浓缩(≤50 ℃)至500 mL，得水提液[14-15]，摇匀，取水提液5 mL，精密加入浓氨试液-甲醇(1∶20)混合溶液5 mL，混匀后静置30 min，水浴锅蒸干，残渣用60%甲醇复溶，定容至5 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液 精密称取延胡索乙素、去氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索甲素对照品适量，加甲醇溶解，制备成质量浓度为1 mg/mL的溶液。

2.1.4 色谱条件 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸(三乙胺调pH值至7.0)，梯度洗脱，程序见表2；体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃；检测波长280 nm；进样量5 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.1.5 多元统计分析 本研究将HPLC数据经Excel软件预处理后，导入Simca-p13.0软件进行正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis, OPLS-DA)，OPLS-DA以变量载荷评价参数(Variable Importance for the Projection, VIP)来描述变量的贡献程度，以VIP>1的变量作为特征变量，分析延胡索与醋延胡索水提液差异性，筛选出醋制前后特征差异成分。

2.2 潜在质量标志物验证分析

2.2.1 特征差异成分潜在作用靶点筛选 特征差异成分在PubChem数据库中下载其化学结构图的sdf.格式以及Smiles化学式。登录反向药效团匹配数据库“PharmMapper”上传sdf.格式文件，然后选择Pharmacophore Models Whose Pkd ≥ 6.0，设置匹配的靶点数目为300，点击submit，获取每种化学成分对应排名前300的靶点。将活性成分对应的Smiles化学式输入SEA与SIB数据库，得到作用靶点，为提高作用靶点的准确度，将这3个数据库得到的作用靶点取交集，作为化学标记物潜在作用靶点，即为成分靶点。运用蛋白质数据库(UniProt)中UniProtKB搜索功能，通过输入靶点名称并限定物种为人，将检索得到的所有靶点校正为其官方名称后，获取与活性成分相关的靶点和Unitprot编号。

2.2.2 疾病潜在作用靶点筛选 利用在线文本挖掘服务器GeneCards、HOME-NCBI-GENE、人类孟德尔遗传OMIM数据库输入关键词查找分析相关的人类基因。通过输入关键词“Analgesia”得到与镇痛相关的作用靶点，即疾病靶点。

2.2.3 作用靶点富集分析及通路图绘制 应用ClueGO version 2.3.4软件与其插件CluePedia分析工具，对特征差异成分作用靶点The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路作富集分析。利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8数据库，输入由ClueGO软件得出的P<0.05的通路，整合绘制最终的通路图。

3 结果

3.1 潜在质量标志物筛选

3.1.1 指纹图谱建立 按“2.1.2”项下方法制备21批供试品溶液，在“2.1.4”项色谱条件下进样分析，将“AIA”文件导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，建立图谱，见图1～3。结果表明，21批延胡索供试品溶液色谱峰数目无显著差异，不同批次之间相同色谱峰峰面积有一定差异，表明不同产地延胡索成分种类无明显差异，但是含量差异显著；延胡索与醋延胡索供试品溶液色谱峰数目无显著差异，醋制后部分色谱峰面积明显增加，表明醋制提高了化学成分的溶出。

图1 21批延胡索指纹图谱

图2 21批醋延胡索指纹图谱

注：A为延胡索供试品溶液，B为醋延胡索供试品溶液。

3.1.2 OPLS-DA分析 结果见图4～5，可知生、醋延胡索能得到较好的分离，模型验证结果(R2X=0.801，R2Y=0.918，Q2=0.844)证明其可靠程度较高。其中，26、23、21、17、10号峰VIP值大于1，可能为延胡索醋制前后的特征差异性成分。

注：CR、VCR分别为延胡索、醋延胡索。

结合对照品比对，可知26号峰为延胡索甲素，10号峰未知，23号峰为延胡索乙素，17号峰为去氢紫堇碱，21号峰为海罂粟碱。大量研究表明，此类成分大多具有镇痛活性，可能是生、醋延胡索药效差异性的物质基础，需进一步通过网络药理学进行验证[16-18]。

图5 各样品VIP得分图

3.2 方法学考察

3.2.1 线性关系考察 取延胡索乙素、去氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为250 μg/mL的贮备液，取适量稀释，在“2.1.4”项色谱条件下进样。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系

在S/N=3时计算检测限，S/N=10时计算定量限，结果延胡索乙素、去氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索甲素检测限分别为2.96、2.91、8.12、16.67 μg/mL，定量限分别为9.87、9.70、27.06、55.57 μg/mL。

3.2.2 精密度试验 取同一份供试品溶液，在“2.1.4”项色谱条件下进样6次，测得延胡索乙素、去氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索甲素峰面积RSD分别为1.32%、1.38%、1.32%、1.30%，表明仪器精密度良好。

3.2.3 重复性试验 取饮片适量，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.4”项色谱条件下进样，测得延胡索乙素、去氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索甲素峰面积RSD分别为1.61%、1.88%、1.43%、1.82%，表明该方法重复性良好。

3.2.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、3、6、9、12、24 h，在“2.1.4”项色谱条件下进样，测得延胡索乙素、去氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索甲素峰面积RSD分别为0.82%、1.07%、1.10%、1.43%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

3.2.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的饮片，每份分别加入50%、100%、150%水平对照品溶液，按“2.1.”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.4”项色谱条件下进样，计算回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果(n=3)

3.3 醋制前后潜在质量标志物含量变化规律 通过外标曲线法测定各批次延胡索和醋延胡索水提液中延胡索乙素、去氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索甲素含量，结果见图6。

注：与延胡索水提液比较，** P<0.01。

结果表明，不同批各成分含量差异较大，延胡索水提液中延胡索乙素、去氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索甲素质量分数分别为0.029 0～0.064 6、0.060 4～0.114 9、0.039 3～0.111 7、0.023 2～0.054 7 mg/g，而醋延胡索水提液中分别为0.045 4～0.087 0、0.075 7～0.122 7、0.066 1～0.176 6、0.063 1～0.978 0 mg/g，表明延胡索醋制后，水提液中主要成分含量提高，其中延胡索乙素、海罂粟碱、延胡索甲素较明显。上述3种成分均为叔胺碱，不易溶于水，而在醋制过程中与醋酸结合生成醋酸盐，增加在水中的溶解度，从而含量大大提高；去氢紫堇碱为季铵碱，以离子形式溶解于水中，醋制过程对其溶出影响不大。

3.4 潜在质量标志物作用靶标及网络验证 将PharmMapper、SEA和SIA数据库得到的所有靶点删除重复，并去除假阳性，整合得到化学标记物作用靶点53个。由GeneCards、HOME-NCBI-GENE-与OMIM数据库检索整合得到的镇痛靶点共312个，成分作用靶点与镇痛作用靶点取交集共得潜在作用靶点20个，主要包括ATP结合和B亚家族成员1转运蛋白基因、乙酰胆碱酯酶、α2 A肾上腺素能受体基因等，与中枢镇痛相关的通路有2条，包括神经活性配体受体相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)[19]、多巴胺神经通路(Dopaminergic synapse)[20-21]，信号相关通路有3条，包括cGMP-PKG信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)[22]、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)[23-24]、钙离子信号通路(Calcium signaling path-way)[25]。

由此表明，特征差异性成分的作用靶点分布于不同的通路，多成分、多靶点相互调节是镇痛的可能作用机制。通过Cytoscape 3.7.2软件建立“成分-靶标-通路”网络关系，见图7，可知上述靶点、通路与镇痛作用密切相关，故延胡索乙素、延胡索甲素、去氢紫堇碱、海罂粟碱可作为延胡索醋制前后潜在质量标志物。

图7 基于潜在质量标志物的“成分-靶点-通路”网络图

4 讨论

本实验建立了生、醋延胡索水提液指纹图谱，通过对比，发现延胡索醋制前后化学成分种类没有变化，但经醋制后，各成分的含量有所提高，随后，采用正交偏最小二乘判别分析对指纹图谱数据进行分析，快速筛选、鉴定出生、醋延胡索的特征差异性成分，结果表明，延胡索醋制后，延胡索乙素、海罂粟碱、延胡索甲素含量增长较为明显，而醋制过程对去氢紫堇碱溶出影响不大，可能与相应成分的结构特性相关。最后，结合网络药理学对特征差异性成分进行网络分析，进一步明确其与生、醋延胡索发挥镇痛药效相关。初步确定延胡索乙素、延胡索甲素、去氢紫堇碱、海罂粟碱可以作为延胡索潜在质量标志物，以期为延胡索质量控制提供理论基础。对于中药炮制前后物质基础的变化及中药饮片质量控制研究等具有借鉴意义。