泽漆水提物对香烟联合LPS所致的COPD大鼠的改善作用

王玲玲， 陈兰英*， 马惠苗， 谢欣序， 刘荣华

(1.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以肺功能障碍和持续的气流受限为特征的阻塞性肺疾病，通常与肺的慢性炎症反应升高有关，其症状包括咳嗽、痰和呼吸困难。吸烟是COPD的主要触发因素[1]，在烟草最为流行的发展中国家，被诊断为慢性阻塞性肺病的患者预计将持续增加，这就需要新的疾病治疗方法。临床上治疗COPD的药物主要是糖皮质激素或支气管扩张剂等，这些药物主要是通过联合作用来控制患者症状，且取得的治疗效果不佳，因此有必要研发一种对于治疗COPD效果好且无副作用的新药。

泽漆又名猫儿眼睛草、五朵云、一把伞等，属大戟科二年生草本植物，《神农本草经》中记载其具有化痰止咳、利水消肿、散结杀虫等作用。现代药理研究表明，泽漆具有抑制支气管腺体中酸性黏多糖合成和使痰量减少的双重作用，并能促进支气管黏膜上皮炎症病理的修复[2]，还具有抗肿瘤、提高机体的免疫功能[3]的作用。有研究报道[4]，泽漆片能用于治疗COPD急性加重期患者，因此本实验旨在探索其水提物对COPD大鼠的治疗作用及对相关因子的影响。

1 材料

1.1 药物 泽漆购自浙江丽水，经江西中医药大学刘荣华教授鉴定为大戟科大戟属草本植物泽漆EuphorbiahelioscopiaL.的干燥地上部分。醋酸地塞米松片(批号1711055)，购自天津力生制药股份有限公司。香烟(焦油量11 mg，烟气一氧化碳量12 mg)，购自江西中烟工业有限责任公司。

1.2 动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量160～180 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK(湘)2016-0002，饲养环境为温度22～26 ℃，相对湿度60%～70%。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准，批准号为JZLLSC-20190171。

1.3 试剂 脂多糖(批号L2880)购自美国Sigma公司；C反应蛋白(CRP)和谷氨酰转肽酶测定试剂盒(GGT)(批号分别为19021402和KR105)购自北京利德曼生化股份有限公司；苏木精和伊红染色液(批号分别为H8070和G1100)、 Masson三色染色试剂盒(批号G1340)购自北京索莱宝科技有限公司；TriZol裂解液(批号15596026)、逆转录试剂盒(货号4368814)、SYBR Green PCR Master mix(批号00710493)购自美国Thermo Scientific公司；生理盐水(批号1903210103)购自浙江都邦药业股份有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)(批号KGB5001)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；异丙醇(批号67-63-0)购自西陇化工股份有限公司；氯仿(批号865-49-6)购自上海麦克林生化科技有限公司；无核酸酶水(批号AM9937)购自美国Ambion公司；无水乙醇(批号64-17-5)购自西陇化工股份有限公司。

1.4 仪器 日立7100型全自动生化分析仪(上海日立高新技术国际贸易有限公司)；WPB PLT-UNR-RT-2型动物肺功能检测系统(法国EMKA公司)；CKX41型倒置显微镜(日本Olympus公司)；RM2016型轮转式切片机(德国Leica公司)；亚光YB-6LF型生物组织石蜡包埋机(孝感市亚光医用电子技术有限公司)；SpectraMax I3型多功能酶标仪(奥地利MD公司);Centrifuge5810R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；ABI750型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Luminex 200型多功能流式点阵仪(美国Luminex公司)。

2 方法

2.1 泽漆水提物制备 取干燥泽漆全草，按照1∶8料液比置于圆底烧瓶中加热提取2次，每次2 h，纱布过滤，合并滤液，减压回收溶剂浓缩，得稠浸膏(得率为20%)，真空条件下低温干燥，即得。

2.2 分组、造模及给药 将72只SD雄性大鼠按体质量随机分为空白组(12只)和模型组(60只)，采用香烟烟雾暴露联合气管内滴入LPS方法来制备COPD大鼠模型[5]。在造模第1、15天，向模型组大鼠气管内滴注0.2 mL 脂多糖(1 mg/mL)，空白组大鼠气管内滴注0.2 mL生理盐水；在第2～14、16～35天，每天将大鼠放在自制的密闭有机玻璃熏烟箱(30 cm×40 cm×60 cm)内给予被动吸烟，2次/d，30 min/次，每次12根香烟(焦油量11 mg，烟气一氧化碳量12 mg)；空白组大鼠给予呼吸正常空气，持续5周，在造模过程中有4只大鼠死亡。造模5周后，将模型大鼠随机分为模型组，地塞米松组(0.81 mg/kg)，泽漆低、中、高剂量组(生药1.25、2.5、5 g/kg)，每组12只，除空白组、模型组大鼠灌胃给予蒸馏水外，其余各组大鼠给予药物治疗，容量为10 mL/kg，1次/d，持续至第28天。

2.3 一般观察 每天注意观察各组大鼠的毛发、活动和精神状态等情况。

2.4 大鼠血清指标检测 大鼠每周进行1次眼眶采血，于4 ℃、3 000 r/min条件下离心15 min，分离血清并吸取适量(80 μL)置于全自动生化仪中，检测GGT、CRP水平。

2.5 大鼠肺功能检测 在给药至第28 天，10%水合氯醛麻醉大鼠后，用肺功能仪及呼吸机连接气管，待大鼠呼吸稳定后测定并记录肺功能相关参数，包括最大呼气流量(Maximum expiratory flow,PEF)、肺动态顺应性(Pulmonary dynamic compliance,Cdyn)、肺活量(Vital capacity,VC)、第0.1秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in 0.1 second,FEV0.1)、潮气量(Tidal volume,TV)、呼气量(Expiratory volume,EV)、每分通气量(Minute ventilation,MV)、呼出50%潮气量时呼气流速(Expiratory flow rate at 50% tidal volume,EF50)。

2.6 大鼠肺泡灌洗液中炎性因子检测 测完大鼠肺功能参数后，立即抽取肺泡灌洗液，预冷PBS冲洗，重复抽取3次，每次3 mL，使其回收率达到75%以上，灌洗经离心后置于-80 ℃冰箱中保存。采用高通量液相蛋白芯片技术，检测大鼠肺泡灌洗液中白介素-1β(IL-1β)、白介素12(IL-12)、白介素17 A(IL-17A)、白介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素13(IL-13)水平。

2.7 大鼠肺组织及气管组织病理学观察

2.7.1 HE染色法检测大鼠肺组织及气管组织病理学变化 收集完 BALF 后，剪取大鼠右肺组织或气管组织，在预冷PBS中稍作漂洗，吸水纸吸干，剪取大鼠右肺组织上叶或气管组织，固定4%多聚甲醛溶液中24 h后，脱水处理并包埋于石蜡中，切片厚度为5 μm，经苏木精及伊红染色、脱水透明、中性树胶封固等步骤后，在显微镜下观察。

2.7.2 Masson染色法检测大鼠肺组织病理学变化 剪取大鼠右肺组织，在预冷PBS中稍作漂洗后固定于4%多聚甲醛溶液中，经常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片、脱蜡等步骤后，根据试剂盒说明书进行Masson染色操作，最后用中性树脂进行封片处理，切片晾干后在显微镜下观察。

2.7.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠肺组织mRNA表达 剪取大鼠右肺组织，Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，扩增条件为活化50 ℃ 1 min，1个循环；预变性95 ℃ 3 s，1个循环；变性95 ℃ 3 s，退火60 ℃ 20 s，共40个循环，以β-actin为内标，采用2-ΔΔCT法计算各组mRNA相对表达。所有引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

3 结果

3.1 一般观察 造模开始第14天，大鼠出现咳嗽并逐渐加重；第20天后弓背蜷缩，喜欢扎堆，经常眯眼，毛发灰黄无光泽并且有部分容易脱落；空白组大鼠不咳嗽，毛发光泽。给药7 d后，地塞米松组、泽漆水提物组大鼠咳嗽症状减轻；10 d后，大鼠毛发逐渐变光亮；20 d后，大鼠毛色发白。与模型组比较，各组大鼠体质量呈缓慢增长趋势，见图1。

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 泽漆水提物对大鼠血清中GGT、CRP水平的影响 在给药期间(第6～9周)，与空白组比较，模型组大鼠(第7、9周)血清中GGT、CRP水平升高(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，第7周泽漆水提物高剂量组大鼠血清中GGT水平降低(P<0.05)，在第7、9周中泽漆水提物组其水平都有不同程度的降低(P<0.01)，见图2～3。

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

3.3 泽漆水提物对大鼠肺功能参数的影响 与空白组比较，模型组大鼠PEF、VC、FEV0.1、MV、EF50、Cdyn、TV、EV、EIP降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，地塞米松组大鼠PEF、FEV0.1、Cdyn升高(P<0.05)，泽漆水提物高剂量组大鼠PEF、 VC、 FEV 、Cdyn升高(P<0.05，P<0.01)，见表2。

表2 泽漆水提物对大鼠肺功能参数的影响

3.4 泽漆水提物对大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、IL-17A、TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10、IL-13水平降低(P<0.01)；与模型组比较，地塞米松组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、 IL-17A、TNF-α水平降低(P<0.01)，IL-10、IL-13水平升高(P<0.01)；泽漆水提物各给药组对大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、IL-17A、TNF-α水平都有不同程度的降低作用，以高剂量组最明显，见表3。

表3 泽漆水提物对大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平的影响

3.5 泽漆水提物对大鼠肺及气管组织病理损伤的影响 空白组大鼠肺泡结构完整，肺泡大小形态正常；模型组大鼠肺泡之间的间隔断裂，存在皱缩融合现象，肺泡结构完整性被破坏；与模型组比较，泽漆水提物各给药组均有不同程度的改善作用，其中地塞米松组和泽漆水提物高剂量组大鼠肺泡结构较为完整，见图4。

图4 泽漆水提物对COPD大鼠肺组织中肺泡病理学变化的影响(HE，×100)

空白组大鼠肺支气管结构完整，四周少量炎性细胞浸润；模型组大鼠的肺支气管管腔狭窄、皱缩，四周有大量炎性细胞浸润，肺支气管形状发生改变；与模型组比较，泽漆水提物各给药组均有不同程度的改善作用，其中地塞米松组和泽漆水提物高剂量组大鼠肺支气管组织炎性细胞浸润程度显著降低，肺支气管结构较为完整，见图5。

图5 泽漆水提物对COPD大鼠肺组织中肺支气管病理学变化的影响(HE，×100)

空白组大鼠肺气管结构完整，黏膜上皮假复层柱状纤毛上皮细胞排列整齐，杯状细胞大小形态完整；与空白组大鼠比较，模型组大鼠的肺气管无显著性差异；与模型组比较，泽漆水提物各给药组的肺气管也无显著差异，表明COPD大鼠的病理损伤主要在小气道，见图6。

图6 泽漆水提物对COPD大鼠肺气管组织病理学变化的影响(HE，×200)

3.6 泽漆水提物对大鼠肺组织胶原的影响 随机选取6个区域，在100倍镜下观察大鼠肺组织Masson染色图，利用Image J软件对各组大鼠胶原纤维的面积进行半定量分析，发现空白组大鼠肺支气管结构完整，四周仅有少量呈丝状沉积；与空白组比较，模型组大鼠的肺支气管管腔狭窄，肺支气管四周有较多胶原沉积(P<0.01)；与模型组比较，地塞米松组及泽漆水提物低、高剂量组上述胶原沉积得到不同程度的改善(P<0.05，P<0.01)，见表4、图7。

表4 泽漆水提物对大鼠肺组织胶原纤维化面积百分比的影响

图7 泽漆水提物对COPD大鼠肺组织Masson染色的影响(×100)

3.7 泽漆水提物对大鼠肺组织中基质金属蛋白酶系统相关mRNA表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠肺组织中MMP-2、MMP-12 mRNA表达升高(P<0.05，P<0.01)，而TIMP-2 mRNA表达降低(P<0.01)；与模型组比较，地塞米松、泽漆水提物各给药组MMP-2、MMP-12 mRNA表达降低(P<0.01)，表明泽漆水提物各给药组能降低MMP-2/TIMP-2值(P<0.01)。与空白组比较，模型组大鼠肺组织中MMP-9 mRNA表达降低(P<0.01)，而TIMP-1 mRNA表达升高(P<0.01)；与模型组比较，地塞米松组MMP-9、TIMP-1 mRNA表达降低(P<0.01)，泽漆水提物中剂量组中MMP-9 mRNA表达升高(P<0.01)，泽漆水提物各给药组TIMP-1 mRNA表达降低(P<0.05，P<0.01)，表明泽漆水提物各给药组能升高MMP-9/TIMP-1值 (P<0.01)，见图8。

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

与空白组比较，模型组大鼠肺组织中IL-6、TGF-β1 mRNA表达升高(P<0.01)；与模型组比较，地塞米松组IL-6、TGF-β1 mRNA表达降低(P<0.01)，泽漆水提物各给药组IL-6、TGF-β1 mRNA表达降低(P<0.01)，见图9。

注：与空白组比较， ##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

3.8 泽漆水提物对大鼠肺组织Th1的IL-12/STAT4信号通路中相关mRNA表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠肺组织中T-bet、IL-12、STAT4 mRNA表达升高(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组T-bet、IL-12、STAT4 mRNA表达降低(P<0.01)，泽漆水提物低、中剂量组T-betmRNA表达降低(P<0.01)，泽漆水提物各给药组中IL-12、STAT4 mRNA表达降低(P<0.05，P<0.01)，见图10。

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.9 泽漆水提物对大鼠肺组织Th2的IL-4/STAT6信号通路中相关mRNA表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠肺组织中GATA-3、IL-4、STAT6 mRNA表达降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，地塞米松组GATA-3、STAT6 mRNA表达升高(P<0.01)，泽漆水提物各给药组GATA-3 mRNA表达升高(P<0.01)，泽漆水提物低剂量组IL-4、STAT6 mRNA表达升高(P<0.01)，高剂量组IL-4 mRNA表达升高(P<0.01)，见图11。

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

根据大鼠肺组织Th1的关键转录因子T-Bet和Th2的关键转录因子GATA-3的数据，并统计T-Bet与Th2、IL-4与IL-12、STAT4与STAT6之间的比值，发现泽漆水提物低、中剂量组可通过调节COPD大鼠Th1/Th2之间的平衡关系来达到抗炎作用，见图12。

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以气流受限为特征的一种不可逆疾病，通常与肺部慢性炎症反应升高有关[6]。慢性炎症会导致气道壁增厚、肺泡分离、气道-实质相互依赖减少进而导致管腔狭窄[7]。本实验采用香烟烟雾暴露联合模拟细菌感染产生的内毒素来制备COPD大鼠模型，研究结果显示，模型组大鼠肺功能参数下降、气道狭窄、肺组织炎性细胞浸润、肺支气管胶原沉积等这些病理组织学变化都证实COPD大鼠模型制备成功。给药组大鼠肺功能参数及组织病理学变化都得到明显改善，这表明泽漆对COPD大鼠具有一定的药效。

血清成分含有多种判断肺损伤的标志物，肺损伤时血清GGT活性和CRP水平均明显升高[8-9]。此外，CRP和GGT也与炎症反应密切相关[8,10]。本研究结果显示地塞米松组及泽漆给药组能明显降低大鼠血清中CRP水平，对GGT有一定的降低作用，提示泽漆减轻COPD大鼠的炎症反应。

TGF-β1是一种重要的致纤维化细胞因子，上皮细胞和巨噬细胞能释放TGF-β1，从而触发纤维母细胞增生导致组织重构[11]。有研究表明TGF-β1能通过促进基质金属蛋白酶抑制剂的作用从而抑制基质金属蛋白酶(MMPS)的活性，从而刺激成纤维细胞和巨噬细胞合成并释放促炎和致纤维化细胞因子，进而参与肺纤维化的形成，减少胶原的降解[12]，当机体出现肺组织纤维化时，肺组织间质有大量的细胞外基质(ECM)堆积，会导致MMP/TIMP系统发生紊乱。本研究结果显示，模型组中TIMP-1 mRNA表达升高，而MMP-9 mRNA表达降低，这表明模型组大鼠的MMP-9/TIMP-1系统功能出现异常，进而导致ECM增多。泽漆降低大鼠肺组织中TGF-β1、TIMP-1 mRNA表达而升高MMP-9的mRNA表达，这表明泽漆能通过降低TGF-β1、调节MMP-9/TIMP-1平衡系统，减少肺组织中胶原的沉积，进而改善COPD大鼠肺组织纤维化。

MMPs可被吸烟或氧化应激激活[13]，最终导致MMPs表达上调如MMP-2和MMP-12等[14]。TIMPs是MMPs的抑制剂，能阻止MMPs裂解ECM组分[15]。促蛋白水解因子和抗蛋白水解因子及其特异性抑制剂的平衡表达维持了细胞外基质周转的平衡。本研究结果显示地塞米松及泽漆能降低MMP-2、MMP-12和MMP-2/TIMP-2值，这表明泽漆能通过调节MMP-2/TIMP-2之间平衡关系从而减轻大鼠肺纤维化的进程。

COPD是一种与异常免疫反应有关的炎症反应，淋巴细胞参与慢性阻塞性肺病的先天和适应性免疫反应[16]。在不同的细胞因子刺激下，CD4+T细胞向Th1和Th2细胞分化。在其分化和功能上Th1/Th2是一对互相制约的平衡系统，对维持机体内免疫平衡发挥着重要作用，一旦这种平衡被打破，就会导致机体的免疫功能紊乱，进而导致疾病的发生发展[8]，Thl/Th2反应失调与多种慢性气道炎症有关。本研究结果显示地塞米松和泽漆能明显降低大鼠肺泡灌洗液中由Th1细胞中分泌的IL-12、TNF-α、IL-1β的水平，这表明泽漆能通过降低Th1细胞的促炎免疫反应从而调节Th1/Th2之间的平衡关系进而起抗炎作用。

转录蛋白(STAT)是由一系列胞质转录因子组成的信号转导子和激活子，通过调节多种生物过程发挥重要作用[17]。STAT4在IL-12与受体结合后被激活，诱导CD4+T细胞分化为Th1细胞。IL-4能激活STAT6诱导CD4+T细胞分化为Th2细胞。有研究表明，STAT4参与了吸烟诱导的小鼠肺小气道重塑的发展，并指出STAT4的异常表达调控了基质生成和气道成纤维细胞表型[18]。此外，Th1细胞从CD4+T细胞的分化与IL-12/STAT4通路的激活有关，Th2细胞从CD4+T细胞的分化与IL-4/STAT6通路的激活有关。

本研究结果显示地塞米松和泽漆能降低IL-12、T-bet及STAT4的mRNA的表达从而抑制Th1的免疫亢进，起抗炎免疫调节作用。地塞米松组降低了IL-4 mRNA表达，而升高GATA-3及STAT6的mRNA表达，这说明在取材的这个时间点，地塞米松组大鼠已经比泽漆提前进入了转录翻译过程，这可能是地塞米松和泽漆的作用时间点不一致所致。泽漆能升高IL-4、GATA-3及STAT6的mRNA表达及从而增强Th2的免疫功能。根据大鼠肺组织Th1的关键转录因子T-Bet和Th2的关键转录因子GATA-3两者间的比值， IL-4和IL-12两者的比值及STAT4、STAT6两者的比值关系得出，泽漆可通过降低T-bet/GATA-3、IL-12/IL-4和STAT4/STAT6的比值从而调节COPD大鼠Th1/Th2之间的平衡关系而起抗炎免疫调节作用。

上述结果表明，泽漆可能通过抑制Th1中IL-12/STAT4通路的激活并促进Th2中IL-4/STAT6通路的激活来调节Th1/Th2之间的平衡关系，从而对COPD大鼠起抗炎作用。当机体的炎症介质和抗炎介质保持平衡时，身体保持健康状态。当这种平衡转向炎症介质时，器官、组织或细胞将触发炎症反应。因此，纠正炎症与抗炎症的不平衡是治疗慢性阻塞性肺病的策略之一。本实验结果为泽漆在治疗COPD的临床应用提供了实验依据，为开发抗COPD的药物奠定了基础。