通宣理肺丸HPLC指纹图谱建立及7种成分测定

2021-10-26张国强邱国玉石晓峰

中成药 2021年10期

李运，王苗，张国强，邱国玉，石晓峰，戴忠

(1.兰州市食品药品检验检测研究院/甘肃省种植中药材外源性污染物监测工程研究中心，甘肃兰州 730000；2.兰州大学药学院，甘肃兰州 730000；3.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000；4.甘肃省医学科学研究院，甘肃兰州 730050；5.中国食品药品检定研究院，北京 100050)

通宣理肺丸由紫苏叶、前胡、桔梗等11味药材组成[1]，方中君药紫苏叶、麻黄辛温宣肺，发散风寒；臣药前胡、桔梗辅助君药宣通肺气，杏仁润肺止咳，半夏、陈皮、茯苓燥湿化痰；佐以黄芩清肺以防肺气郁久化热，枳壳行气消痰；甘草为使药，调和诸药，全方共奏通宣理肺之功效，临床应用较广，但现行质量标准不能较全面的对其质量进行控制。因此，需借鉴指纹图谱[2]、特征图谱[3]、多成分测定[4-5]、数理统计[6]等方法，充分体现中药整体或部分化学特性的谱图，最大限度地表征药效相关成分或特征成分[7]，从而在中药质量控制与评价中发挥重要的作用。

近年来，有学者对通宣理肺丸中橙皮苷、柚皮苷[8]、黄芩苷[9]、盐酸麻黄碱[10]、白花前胡甲素、白花前胡乙素[11]含量进行了测定；姚蓉等[12]筛查了前胡投料情况，并对其特征成分含量进行测定；孙国祥等[13]采用毛细管区带电泳，建立全方指纹图谱。本实验在前期报道及刘昌孝院士[14-15]提出“中药质量标志物”概念的基础上，选择与中药质量特性密切相关的标志物，建立通宣理肺丸HPLC指纹图谱，并对甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、白花前胡甲素含量进行测定，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695液相色谱仪(美国Waters公司)；SBL-10DT超声波恒温清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；XSE205DU电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q IQ7000超纯水机(美国默克密理博公司)；ChemPattern化学计量学软件[科迈恩(北京)科技有限公司]。

1.2 试剂与药物甘草苷(批号111610-201908，纯度95%)、柚皮苷(批号110722-201815，纯度91.7%)、橙皮苷(批号110721-202019，纯度95.3%)、新橙皮苷(批号111857-201804，纯度99.4%)、甘草酸铵(批号110731-201619，纯度96.2%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；黄芩苷(批号8369，纯度96.2%)、白花前胡甲素(批号5636，纯度99.2%)对照品均购自上海诗丹德生物技术有限公司。通宣理肺丸(大蜜丸)31批，编号S1～S31，具体见表1。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯；纯化水为实验室自制。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 CAPCELL PAK C18MG色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相水(含0.1%甲酸)(A)-80%乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min，15%B；5～10 min，15%～20%B；10～20 min，20%～25%B；20～30 min，25%B；30～40 min，25%～48%B；40～45 min，48%～70%B；45～55 min，70%～90%B；56～60 min，90%～15%B)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长250 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取各对照品适量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，即得(甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、白花前胡甲素质量浓度分别为1.003 2、0.989 4、0.582 3、1.064 6、0.575 3、1.335 3、1.174 5 mg/mL)，4 ℃下保存备用。

2.2.2 供试品溶液取样品(S3)适量，剪碎，混匀，取约1 g，精密称定，加硅藻土1 g，研匀，置于150 mL锥形瓶中，精密加入70%乙醇25.00 mL，称定质量，超声提取30 min，静置冷却，70%乙醇补足减失的质量，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按处方比例及工艺，分别制得缺甘草，缺陈皮，缺陈皮、枳壳，缺黄芩，缺前胡，缺甘草、黄芩、前胡、陈皮、枳壳的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验取样品(S3)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项下色谱条件进样测定6次，以18号峰(黄芩苷)为参照，测得各共有峰相对保留时间 RSD为0.052%～0.501%，相对峰面积RSD为0.856%～2.650%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验取样品(S3)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定，以18号峰(黄芩苷)为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD为0.026%～1.000%，相对峰面积RSD为1.017%～2.498%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取样品(S3)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，以18号峰(黄芩苷)为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD为0.035%～1.638%，相对峰面积RSD为1.005%～2.826%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 图谱生成取31批样品(S1～S31)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见图1，将所得数据导入ChemPattern软件，设置积分条件(斜率0.01，最小相对峰高0.1%，最小百分比峰面积0.25%，积分开始3，积分结束300)，以75%(高四分位数)为共有峰筛选条件，采用高斯曲线模拟生成共有模式，发现39个共有峰，见图2。

图1 31批样品HPLC指纹图谱

10.甘草苷 13.柚皮苷 14.橙皮苷 15.新橙皮苷 18.黄芩苷 30.甘草酸 39.白花前胡甲素 10.liquiritin 13.naringin 14.hesperidin 15. neo-hesperidin 18.baicalin 30. glycyrrhizic acid 39.praeruptorin A

2.3.5 相似度分析采用ChemPattern软件，以HPLC指纹图谱共有模式为参照图谱，通过夹角余弦法计算各样品相似度，见表2，可知相似度为0.16～0.99，其中有77.4%大于0.95，表明不同企业样品质量差异较大，其中Y2、Y3企业有3批低于0.6，均存在部分特征峰丢失或者峰面积偏小的情况。

表2 31批样品相似度

2.3.6 聚类分析采用ChemPattern软件将31批样品HPLC指纹图谱数据进行标准化后，以街区距离为度量，通过远邻法进行聚类分析，结果见图3。

图3 31批样品聚类分析图

2.3.7 主成分分析采用ChemPattern软件进行主成分分析，结果见图4。由此可知，第一主成分(PC1)、第二主成分(PC2)、第三主成分(PC3)贡献率分别为65.13%、25.64%、3.99%，总计94.76%，能较好地反映各批样品之间的差异；峰18、3、28、1、14、33、12、25、39是主要标志性成分，与对照品图谱比对，可知峰14为橙皮苷，峰18为黄芩苷，峰39为白花前胡甲素。

图4 31批样品主成分分析图

2.4 含量测定

2.4.1 专属性试验取“2.2”项下对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见图5。由此可知，各成分分离度良好，丸剂中其他共存物质对测定结果无干扰，理论塔板数以黄芩苷(5号峰)计，不得低于6 000。

1.甘草苷 2.柚皮苷 3.橙皮苷 4.新橙皮苷 5.黄芩苷 6.甘草酸 7.白花前胡甲素

2.4.2 线性关系考察精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系

2.4.3 精密度试验取“2.3.2”项下对照品溶液(甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、白花前胡甲素质量浓度分别为100.32、98.94、58.23、106.46、57.53、133.53、117.45 μg/mL)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、白花前胡甲素峰面积RSD分别为2.8%、2.3%、1.7%、0.6%、0.4%、0.8%、1.7%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验取同一批样品(S3)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下别进样测定，测得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、白花前胡甲素含量RSD分别为1.88%、2.15%、2.02%、1.93%、1.78%、1.45%、2.19%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验取同一批样品(S3)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、白花前胡甲素峰面积RSD分别为2.49%、2.32%、2.00%、2.12%、1.05%、1.24%、2.08%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率实验精密称取各成分含量已知的样品(S3)0.5 g，共6份，加入对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、白花前胡甲素平均加样回收率分别为99.89%、113.3%、101.2%、105.2%、93.10%、98.10%、106.6%，RSD分别为2.29%、2.58%、2.52%、1.61%、3.86%、1.25%、2.41%。

2.5 样品含量测定取31批样品，每批2份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(%，n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件优化

3.1.1 流动相本实验考察了90%乙腈-水(含0.2%磷酸)、80%乙腈-水(含0.2%磷酸)、80%乙腈-水(含0.1%甲酸)，发现80%乙腈-水(含0.1%甲酸)梯度洗脱60 min时，各成分色谱峰峰形较好。

3.1.2 检测波长本实验采用二极管阵列检测器对各成分进行全波长扫描，综合考虑不同吸收波长处的图谱响应强度，最终确定250 nm作为检测波长，此时各成分检测灵敏度较好，干扰小。

3.2 提取条件优化本实验考察了不同提取方法(超声、回流)、提取溶剂(70%乙醇、70%甲醇、甲醇)、提取时间(30 min、1 h、1.5 h)，结合绿色分析的需要，最终确定25 mL 70%乙醇超声提取30 min作为提取条件。

3.3 含量测定分析企业Y1、Y4、Y5、Y6、Y7样品之间的相似度均大于0.95，质量均一性良好；Y2、Y3不同批次及同一批次样品之间存在较大差异。31批样品中，甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、白花前胡甲素质量分数范围分别为0.001 2%～0.063 1%、0.083 8%～0.209 8%、0.007 1%～0.258 4%、0.051 4%～0.207 7%、1.43%～4.31%、0.046 4%～0.087 9%、0.013 1%～0.046 1%，差异较明显，故对通宣理肺丸质量的整体控制方法有待进一步完善。