大黄素纳米结构脂质载体在大鼠体内的药动学及组织分布

马 开， 辛玉凤， 田 萍， 位恒超， 祝侠丽， 刘雅敏， 韩德恩,3*

(1.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004；2.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046；3.河南省中药特色炮制技术工程研究中心，河南 郑州 450046)

大黄素是一种游离型蒽醌化合物，为大黄主要化学成分之一[1]，具有抗炎[2-3]、镇痛[4]、抗菌[5]、抗肿瘤[6]、保护器官[7]等多种药理作用，但该成分具有水溶性差、半衰期短、生物利用度低等缺点[8]，从而限制了其临床应用。纳米结构脂质载体是在固体脂质纳米粒的基础上，以固体和液体混合脂质为载体制备的新型纳米载药系统，它克服了后者载药量低、贮存过程中药物易泄漏等缺陷[9]，不仅具有生物兼容性良好、药物生物利用度高等优点，还有着缓释靶向作用[10]，同时药物药动学和组织分布也会发生显著变化[11-13]，开发前景良好。

课题组前期已对大黄素纳米结构脂质载体制备工艺进行优化[14]，本实验在此基础上灌胃给予大鼠该制剂，采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)法测定不同时间点大鼠血浆及各组织中该成分血药浓度，考察其体内药动学及组织分布，以期为相关制剂后续开发及临床应用提供依据。

1 材料

超高效液相色谱-四级杆轨道肼高分辨质谱仪(UPLC-Q-Orbitrap HRMS，美国赛默飞世尔科技公司)；MS105DU电子分析天平(十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；UPD-Ⅱ-107优普超纯水机(成都超纯科技有限公司)；VORTEX3旋涡混匀器(德国IKA公司)；JW-3021HR高速冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；EFAA-DC24-RT氮吹仪(上海安谱科学仪器有限公司)。

大黄素、甲基异茜草素(批号分别为wkq16071004、wkq18012405，纯度>98%，四川省维克奇生物科技有限公司)；肉豆蔻酸异丙酯(批号N18100621)、单硬脂酸甘油酯(批号N18051206)、大豆卵磷脂(批号N18061105)、泊洛沙姆188(批号N18110725)均购自南京都莱生物技术有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。

SPF级SD大鼠，雄性，体质量(235±20)g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号SCXK(鲁)20190003，标准环境下饲养1周。动物实验方案获得河南中医药大学实验动物伦理委员会批准。

2 方法与结果

2.1 大黄素纳米结构脂质载体制备 参考文献[14]报道，精密称取3.27 mg大黄素、200.00 mg单硬脂酸甘油酯、148.68 mg肉豆蔻酸异丙酯，加入少量无水乙醇助溶，65 ℃下加热熔融，挥干乙醇，作为油相；精密称取100.00 mg大豆卵磷脂、173.48 mg泊洛沙姆188，水浴加热至60 ℃，作为水相，磁力搅拌(1 000 r/min)下将水相趁热滴加到乙醇挥尽的油相中，制成O/W型初乳，迅速用探头超声30 min(每工作2 s停止2 s)，冰水浴冷却固化，定容至20 mL，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2 对照品、内标溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取大黄素对照品5.20 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超声溶解并定容至刻度，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，制成5.2 μg/mL贮备液，甲醇稀释至1.04、2.08、5.20、10.40、20.80、52.00、104.00、520.00、1040.00 ng/mL，即得。

2.2.2 内标溶液 精密称取甲基异茜草素对照品4.67 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超声溶解并定容至刻度，制成46.7 μg/mL贮备液，精密量取0.5 mL，置于100 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(质量浓度为0.233 μg/mL)，4 ℃下冷藏备用。

2.3 分析条件

2.3.1 色谱 Waters ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相0.1%甲酸-乙腈(15∶85)；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

2.3.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)，选择性离子监测模式(SIM)；喷雾电压3.0 kV；离子传输管温度350 ℃；加热器温度300 ℃；鞘气体积流量35 arb，辅助气体积流量10 arb；碰撞能量45 V；定量离子(大黄素)m/z269.045 1；内标(甲基异茜草素)m/z253.049 8。

2.4 生物样本前处理 精密吸取50 μL血浆，置于1.5 mL离心管中，加入50 μL 0.233 μg/mL内标(甲基异茜草素)溶液，涡旋混合30 s，再加入400 μL蛋白沉淀剂(甲醇)，涡旋混合3 min，12 000 r/min 离心5 min，取300 μL上清液，氮气吹干，残渣加100 μL甲醇复溶，12 000 r/min离心5 min，取上清液。

取组织样品1 g，加入3 mL 0.9% NaCl溶液进行匀浆，精密吸取匀浆液50 μL，置于1.5 mL离心管中，加入50 μL 0.233 μg/mL内标溶液，涡旋混合30 s，再加入400 μL蛋白沉淀剂(甲醇)，涡旋混合3 min，12 000 r/min 离心5 min，取300 μL上清液，氮气吹干，残渣加100 μL甲醇复溶，12 000 r/min离心5 min，取上清液，待测。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 取空白血浆/组织匀浆样品、含药血浆/组织匀浆样品(2.6 ng/mL大黄素)、给药1 h后血浆/组织匀浆样品加内标(甲基异茜草素)溶液，在“2.3”项条件下测定，结果见图1。由此可知，血浆、组织样品中无内源性物质或其他杂质干扰，专属性良好，可满足生物样品测定要求。

2.5.2 线性关系考察 取50 μL大鼠空白血浆/组织匀浆样品9份，加入“2.2”项下对照品溶液各50 μL，制成含0.5、1.0、2.6、5.2、10.0、26.0、52.0、260.0、520.0 ng/mL大黄素的样品溶液，按“2.4”项下方法处理，在“2.3”项条件下进样测定；质控样品制备方法同标准曲线，低、中、高质量浓度分别为2.6、26.0、260.0 ng/mL。以待测物与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 大鼠血浆/组织中大黄素线性关系

2.5.3 准确度、精密度试验 取2.6、26.0、260.0 ng/mL质控样品溶液各5份，连续3 d在“2.3”项条件下进样测定，结果见表2，可知该方法准确可靠，重复性好，符合生物样品检测要求。

表2 大黄素准确度、精密度试验结果(n=6)

2.5.4 稳定性试验 取2.6、26.0、260.0 ng/mL质控样品溶液各5份，按“2.4”项下方法处理，在“2.3”项条件下进样测定，分别考察大黄素在-20 ℃下反复冻融3次、-80 ℃下冷冻保存30 d、室温下放置12 h的稳定性，结果见表3，可知该方法稳定性良好，符合生物样品检测要求。

表3 大黄素稳定性试验结果(n=6)

2.5.5 提取回收率、基质效应试验 取2.6、26.0、260.0 ng/mL质控样品溶液，在“2.3”项条件下进样测定，得峰面积A；取空白血浆/组织适量，按“2.4”项下方法处理(不加内标)，上清液中加入相应质量浓度的对照品、内标溶液，在“2.3”项条件下进样测定，得峰面积B；向50%乙腈中加入相应质量浓度的对照品、内标溶液，在“2.3”项条件下进样测定，得峰面积C，以(A/B)×100%计算提取回收率，(B/C)×100%计算基质效应，结果见表4，可知提取回收率良好，基质效应范围97.3%～101.3%，符合生物样品检测要求。

表4 大黄素提取回收率、基质效应试验结果(n=6)

2.6 药动学研究 12只大鼠随机分成2组，每组6只，给药前12 h禁食不禁水，1组灌胃给予大黄素混悬剂，剂量为10 mg/kg，另1组灌胃给予相同剂量大黄素纳米结构脂质载体混悬剂，于给药前及给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h眼眶静脉窦取血各约0.3 mL，血液样品置于预先肝素化的1.5 mL离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上层血浆，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS法测定大黄素血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线，见图2。再通过DAS 2.0软件进行非房室模型拟合，SPSS 19.0软件进行统计学分析，药动学参数见表5，可知纳米结构脂质载体Cmax是原料药的1.39倍，相对生物利用度为182.98%，同时t1/2、MRT延长(P<0.01)，有助于发挥其长效缓释作用。

表5 大黄素主要药动学参数

图2 大黄素血药浓度-时间曲线

2.7 体内组织分布研究 取24只大鼠，按“2.6”项下方法分组给药，分别于灌胃0.5、1.5、3、6 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，每个时间点3只，再立即处死，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，生理盐水洗涤至各组织表面无血色，滤纸将水分吸干，置于冷冻管中，液氮速冻15 min，-80 ℃下保存待用，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS法测定大黄素含量，结果见图3。由此可知，大黄素含量在肝脏中最高，其次在肺脏中，脾脏中最低；大鼠给予原料药0.5 h后，该成分在肝脏中的含量高于给予纳米结构脂质载体后，随着时间的推移逐渐逆转，而且后者下降速度明显慢于前者，表明纳米结构脂质载体在大鼠肝脏中具有一定的缓释靶向作用。

图3 大鼠各组织中大黄素含量

3 讨论

血浆样品常用的前处理方法有液-液萃取、固相萃取、蛋白沉淀，其中蛋白沉淀重复性好，成本较低，是蒽醌类成分生物样品预处理的常用手段[15-16]。本实验考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯对大黄素的提取回收率的影响，发现甲醇去除蛋白时杂质干扰少，提取回收率较高，符合生物样品测定要求。

药动学结果显示，大黄素混悬液Cmax为75.81 ng/mL，而其纳米结构脂质载体为105.77 ng/mL，可能是因为纳米结构脂质载体粒径较小，增加了与胃肠道黏膜的接触面积，有利于药物吸收；在大黄素纳米结构脂质载体中加入磷脂、泊洛沙姆188时，可提高胃肠道黏膜通透性，促进药物吸收[17]，从而增加Cmax；两者AUC0～∞分别为398.56、729.27 ng/mL·h，相对生物利用度为182.98%，表明药物吸收程度大大提高；两者t1/2分别为9.06、2.36 h，体现了大黄素纳米结构脂质载体的缓释效应。