结核分枝杆菌耐药基因检测在耐药肺结核治疗中的价值分析

陈泽莲，张肇月，张美霞

（自贡市第一人民医院呼吸与危重症医学科 四川 自贡 643000）

肺结核是临床常见病之一，而我国则是结核病的高负担国家，据相关统计显示，在全球肺结核患者中，我国占比约为1/4。在此病的治疗中，药物是主要治疗手段，但在临床药物使用增加的同时，耐药肺结核患者也随之提高，想要进一步确保耐药肺结核的诊断准确率，加大对检测方法的研究就极为关键[1]。本文主要就结核分枝杆菌耐药基因检测在耐药肺结核治疗中的应用价值进行研究、分析，现报告如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

本次入选人员均选自2019 年6 月—2020 年6 月我院收治的涂阳患者（80 例），采取数字法随机分为对照组（40 例）和观察组（40 例）。其中，对照组男22 例、女18 例，年龄27 ～76 岁；观察组男24 例、女16 例，年龄28 ～76 岁。纳入标准：所有患者均符合肺结核临床诊断标准，自愿参与此次研究。排除标准：合并其他严重疾病、精神异常、资料不全者。在研究开始前，患者及其家属均提前知晓了有关内容，并签署了知情同意书。两组一般资料比较差异不具有统计学意义（P＞0.05），有可比性。

1.2 方法

在实际的治疗中，应用的药物包括了乙胺丁醇、利福平、异烟肼。对照组实施常规药敏试验，具体方法：使用K-B 试纸扩散法，基于无菌前提下，结合NCCIS 试验标准对细菌的耐药性进行判断、鉴定。观察组实施结核分枝杆菌耐药基因检测聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)熔解曲线法，具体方法：取患者的痰标本，落实细菌培养，将病原菌分离，使用符合相关标准的试剂盒完成DNA 提取，基于设计好的引物前提下展开PCR 扩增，落实对DNA 单链构象多态性分析，电泳处理非变性聚丙烯酰胺凝胶孔，将温度、电压分别设定为4℃、130 ～150 v，经4 ～5 小时后，将凝胶板取出，使用银染法予以染色处理，将结核分枝杆菌标准株h37Rv 作为对照。

1.3 统计学方法

使用SPSS 20.0 统计软件完成所有数据的统计、分析，t、χ2分别用于计量、计数资料的检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 耐药分析

通过相应的检测发现，观察组检出耐1 种药物的有4 例，同时耐药2 种药物的有2 例，而对照组患者检出1 种药物耐药的有5 例，同时耐2 种、3 种药物的分别有3 例、1 例，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组患者的耐药情况对比[n（%）]

2.2 基因检测

80 例患者中，利福平耐药株有14 株，突变株数6 株；异烟肼耐药株18 株，突变株数10 株；乙胺丁醇耐药株16 株，突变株数8 株。三种耐药基因突变率差异不明显（P＞0.05）。见表2。

表2 两组患者的基因检测情况对比

3.讨论

针对肺结核疾病而言，其属于重大传染性疾病，危险性较高，严重影响着人们的健康及生活质量。据相关报道指出，相较于发达国家，我国结核病的发生率、死亡率及病菌耐药率均较高，每年因结核病死亡的人数高达13 万[2]。在此病的治疗中，往往会使用抗菌药物，如乙胺丁醇、利福平、异烟肼等，可达到对肺结核疾病发生及传播遏制的目的。但值得注意的是，在病原菌耐药性增加的同时，抗菌药物抗感染效率也出现了一定的差异，故为进一步确保治疗效果，重视对药物的细菌耐药性判断就显得尤为重要，在治疗方案中起着明显的指导作用[3]。

有研究指出，结核分枝杆菌耐乙胺丁醇与embB 和306 位点的变异有关；耐异烟肼，与氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG 基因缺失有一定关联；耐利福平的产生，则与核心区域rpoB 基因图片有一定关系。通过对结核病致病体的检测以及耐药性的分析，有利于为疾病的防治提供更加准确的参考依据[4]。在基于治疗次数和耐药性关系的前提下来说，认为两者呈正相关性，有临床研究指出，相较于首次治疗的患者，结核病二次复发接受治疗的患者，其耐药率相对较高。由此就可看出，落实对耐药率的分析，可为临床用药提供指导。既往研究在对耐药性进行分析时，往往会忽略患者的诊治次数，导致耐药性分析不够客观，也影响了分析结果的准确性。近年来，对于治疗次数和耐药率方面的研究越来越多，发现初次诊治失败的患者行二次治疗后，其耐药率明显较高，认为与抗结核药物的剂量有一定关系，从而就增强了结核分枝杆菌的耐药性。因此，在对结核病患者进行治疗时，要确保选择科学的治疗方法，尽可能的缩短疗程，重视疾病的复发，降低病菌耐药性[5]。

在测定结核分枝杆菌耐药性中，往往会采用比例法、浓度法等，但有学者指出，这些测定方法需要耗费较长的时间，一般在6 ～8 周，特殊情况下甚至更长，这就难以确保治疗的及时性[6]。近些年来，在分子生物技术不断进步的背景下，分枝杆菌耐利福平、耐异烟肼等相关基因被发现。有研究指出，在检测rpsL、KatG 等基因图片检测中发现，rpsL、KatG 等基因突变率较高，高达90%，本文中相关药物耐药株基因也较高，这与相关文献报道相符[7]。由此就可看出，在耐药基因检测中，荧光PCR 熔解曲线法的优势明显，主要体现于灵敏性高、特异性高等方面，但值得注意的是，此方法虽然具有较高的应用价值，但实际操作中仍存在一些亟需解决的问题，即操作较为繁琐，极有可能出现交叉感染现象等。有研究指出，在基因检测中，LAMP 法、荧光PCR 熔解曲线法均具备较高的特异性及灵敏性，无需应用特殊试剂及预先行双链DNA 变性，其中荧光PCR 熔解曲线法优势主要体现于快速、简便、准确等方面。值得注意的是，荧光PCR 熔解曲线法需要应用特殊的仪器，且对试验环境以及试剂提出了较高的要求。另有研究指出，在耐药结核分枝杆菌菌株突变方面，荧光PCR 熔解曲线可提供帮助，对于一线、二线抗结核药物的耐药性可同时检测出，这就直接规避了表型药物敏感实验的不足，可快速获取检测结果。通过分析发现，对于耐多药 结核分枝杆菌菌株而言，其在EMB、SM 表型耐药中的稳定性不强，与表型检测试验相比，荧光PCR 溶解曲线法的应用价值更高。但是，此方法往往也会受到一定局限，即受方法筛选无氨基酸序列的影响，就极易导致氨基酸改变的突变，从而被判定为突变型。另外，如若检测样品的耐药菌株不均一，菌株比例过于偏低，就可能被判定为敏感型，引发假阴性问题。

综上所述，结核病是较为常见的一种慢性传染疾病，发病机制为结核分枝杆菌感染，药物是主要治疗手段，常用的有乙胺丁醇、异烟肼等，能够控制患者病情的发展，减少死亡率。因此，在肺结核的治疗中，就需落实对结核分枝杆菌耐药性的检测及分析，合理的选用检测技术，以确保检测结果的准确性，从而为患者的诊治提供参考，这也是避免患者错过最佳治疗时机的关键，应引起重视。