论硝基呋喃类抗生素衍生成功的条件

马明玲

摘要：硝基呋喃类药物因代谢迅速，通过测定母体化合物的方法测定其残留是不合适的。又因其代谢物在动物的可食用组织中长期残留，所以人类才要加以控制，检测。因此，硝基呋喃类药物衍生化就成为重中之重，其衍生化又有一定的困难性，所以通过加衍生药物、衍生条件、调PH值、离心力等方面论述其成功的关键信息，以利于质谱检测。

关键词：转移、避光、PH值、涡旋、离心、氮吹萃取、质谱

Because of rapid metabolism，it is not suitable to determine the residue of nitrofurans by the method of determining the parent compound.And because of its metabolites in the edible tissue of animals for a long time，so human control，detection.Therefore，nitroflavan drugs biochemistry has become a top priority，because of its biochemistry is difficult to control，so by adding raw drugs，raw conditions，cycle name，centrifugal force and other aspects to discuss the key information of its success，in order to facilitate mass spectrometry detection.

正文

硝基呋喃類药物在现代农业中应用广泛，兽类应用尤其众多，其在动物可食用组织中长期残留，对人体有极其重要的影响，所以国家对其一直很重视，对兽残要求和控制很严格，也加强了检测的力度，因此企事业单位也开始检测兽残和农残，并且这以后会成为社会检测的主流。

硝基呋喃类抗生素代谢物的分子量小，不利于质谱检测，又因其离子化效率很小（很难离子化），无法达到所需要的检测灵敏度，再加上其代谢物上机检测时在色谱上保留、分离不好，所以要有更稳定的物质来代替它，因此硝基呋喃类抗生素衍生化应运而生，衍生化后改善其色谱行为，利于质谱检测，所以硝基呋喃类抗生素进行衍生化的效果和程度就成为其检测的关键点，也就是各种食用物品中有无此物质的控制点。

要检测硝基呋喃类一般外标有四个分别是3-氨基-5-吗啉甲基-2-噁唑烷酮（AMOZ）、3-氨基-2-噁唑烷酮（AOZ）、盐酸氨基脲（SEM·HCL）、1-氨基海因盐酸盐（AHD）以及四个内标3-氨基-5-吗啉甲基-2-噁唑烷酮-D5（AMOZ-D5）3-氨基-2-噁唑烷酮-D5（AOZ-D5）、氨基脲-13C，15N2盐酸盐（SEM·HCL-13C，15N2）、1-氨基-2-乙内酰脲-13C3（AHD-13C3），这八种物质都冷冻保存在甲醇中，一般情况是比较稳定的，但检测过程中状况复杂就会使结果不稳定，所以就要衍生成比较稳定的物质，使检测效果达到最佳。

为探索硝基呋喃类抗生素衍生化的条件，参考国标GB/T21167--2007及一些检测机构的经验，连续几天不断对其衍生条件进行实验，特总结出以下几点。

1、对于不熟练的实验人员，先从标准品的配制和衍生开始。将标准品先从安瓿瓶中转移出来，此转移过程一定要准确迅速，而后根据其浓度配制成浓度为100ng/ml和10ng/ml的两种标准混合溶液（注意要存放在棕色玻璃瓶中放在冰箱冷冻层），供衍生化使用。

在进行衍生之前要先配制1mol/L的盐酸，做实验当天要先配制50mmol/L的衍生化药物邻硝基苯甲醛。做好准备后，就开始标准品的衍生化，为方便标准品梯度的建立，可以参考国标GB/T21167--2007中的梯度，分别从100ng/ml和10ng/ml的两种标准混合溶液中准确移取0.20ml、0.10ml和0.050ml至干净的50ml玻璃离心管中，再分别加入100ng/ml的内标混合溶液0.10ml，之后再分别加入0.50ml1mol/L的盐酸、200ul50mmol/L邻硝基苯甲醛（2-NBA）溶液，此整个过程要迅速，时间越短越好，在旋涡混匀器上快速混合60秒。

2、对于上述处理好的溶液离心管迅速放入37℃水浴避光振荡过夜16小时以上，此环节避光、温度、振荡三者缺一不可，有光条件下对衍生影响极大，所以注意避光这个条件，以上加入了盐酸，所以酸性环境也是衍生的关键点，这些条件都是必不可少的，都要认真对待。

3、衍生化16小时后，就要调节PH值（用5.5--9.0的PH试纸控制PH值比较合适），这是非常关键的环节，有两个方案：其一 加入4ml磷酸氢二钾缓冲溶液，一般再加入0.2ml左右磷酸氢二钾缓冲溶液就可以调节PH值在7.0--7.5之间，暂时颜色靠近7.5的PH值比较符合衍生后溶液稳定性的标准。其二加入4ml磷酸氢二钾缓冲溶液增加衍生物的稳定性，再用1mol/L的氢氧化钠溶液调节PH值在7.0--7.5之间，PH试纸的颜色同其一中的颜色标准。

4、调节好PH值后，需要加入乙酸乙酯提取，此过程中需要涡旋和离心，这个混合过程也很重要，使溶液中有用的衍生物充分溶入乙酸乙酯中，衍生化后所有有用衍生物是否完全提取出来，此过程万分重要。不管提取几次，涡旋一定要达到60秒，离心建议10000转每分钟离心5分钟，将乙酸乙酯分离出来分别放在新的离心管中，再使用氮吹萃取装置吹干，用乙腈：0.1%甲酸水（3：7）溶解，涡旋充分溶解后分别过0.22um的水系和有机系滤膜，放入进样小瓶中供质谱检测使用。

5、质谱检测过程也非常关键，一天的衍生物尽量当天检测，要有溶剂空白，开始多跑几针让仪器多平衡一会，稳定后测得结果就会比较准确，出峰时间也比较一致，根据仪器的特点制定合理的方法，这样跑出来的结果就会很好看，所以衍生成功后，后期检测也是关键，一定让前处理和仪器都是最佳，就会出来我们想要的结果。

实验过程中可能会出现操作的困难点，这些点都需要多加练习，更需要一些小技巧来应对，若没有这些小技巧，轻则影响检测数据的准确性，重则成影响衍生是否成功的条件，所以一定要加以重视这些关键困难点，这也是我反复试验中总结出来的，特加以论述如下：

1、调PH值的过程中一定要一边加调节试剂一边搅拌，混匀后用玻璃棒蘸取少许在PH试纸上加以测试PH值，直到达到自己想要的结果，加了多少一定要心中有数，可以用移液枪加从多到少，记下加的准确数值，以便于下次实验应用，因为实验在工厂中就相当于生产，进行的是多批量的实验，一切数据和结果都是从固定的量中得到的，也便于比较和筛选，所以每次实验的内外标的加量和衍生试剂的加量都是相同的，只不过由于操作和仪器状态有细微差别而已，所以这个所加调节试剂的量也差别不大，记录下来，一来节省以后实验中调节PH值的时间，二来减少测试过程中试剂量的减少。

2、衍生试剂所加的量，很多资料上都不同，但国标上的量有点少，所以要加点量，但并不代表无限加量，我觉得加200ul50mmol/L邻硝基苯甲醛（2-NBA）溶液配我以上说的加内标和外标的量已足够了。一则加多了，对于精密仪器的质谱也会影响结果;二则加少了，对衍生结果也有影响，对于不太熟练的人员还是这个量比较合适。

3、移液枪的使用也很关键，移液之前，要保证移液枪、枪头和液体处于相同温度。吸取液体时，四指并拢握住移液槍上部，用拇指按住柱塞杆顶端的按钮，用大拇指将按钮按下至第一停点，移液枪保持竖直状态，将枪头插入液面下2-3毫米，然后慢慢松开按钮回原点，吸上液体，并停留1～2秒钟（粘性大的溶液可加长停留时间），将吸头沿器壁滑出容器，排液时吸头接触倾斜的器壁，接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）。最后按下除吸头推杆，将吸头推入废物缸。一定按照这个步骤准确操作，保证吸液的准确性，从而达到实验前处理过程数据的精确度。

4、提取乙酸乙酯的过程也很关键，因为分层无特殊颜色标注，又是液体间的分离，所以有一定的难度，可以选择提取出部分液体，这种方法比较简单，易操作;也可以去全部提取出来，利用吸管一点点吸出来，洗的过程中，注意吸管中的液体分层情况，如果有分层就把下层放回离心管中，直到观察离心管中无分层现象就可以全部提取出来了。

以上几点是我实验过程中总结的要点和注意事项，虽说这个衍生过程不是很难的，但也困扰了一部分实验人员，特意总结出来，论述整个过程的条件和困难点，以使这个实验大众化，让硝基呋喃类化合物的检测更加好操作，检测更加准确，这样就能保证大众的健康。

参考文献

[1]国标GB/T21167--2007

[2]移液枪的使用说明书

感谢

在此特别感谢某蜂蜜生产厂家提供的实验条件和仪器设备，以及在实验过程中给予指导的老师及同仁们，把技术传授给我，才有机会写出来惠及大众;感谢给与支持的家人们，为我提供写这篇文章的所有条件，让我有时间和精力把它完成并最终有所收获。非常感谢！