肺炎支原体肺炎患儿血清micro RNA-21和microRNA-221水平变化及与炎症因子、T淋巴细胞亚群的相关性*

田伟，梁淳，宋亚娟

（邯郸市中心医院 检验科，河北 邯郸056008）

儿童肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）是常见的社区获得性肺部感染疾病之一，是由肺炎支原体感染所致，全年均可能发病，以秋冬季最高，据统计MPP 占儿童社区获得性肺部感染疾病的10%～30%[1]。儿童MPP 临床表现隐匿，在诊疗过程中误诊率及漏诊率较高，严重影响患儿身体健康，因此，及时准确地判断病情是临床治疗的关键。肺炎支原体是一种介于细菌和病毒之间可独立生存的病原微生物，人类是其唯一的宿主，其黏附于宿主细胞后通过堆积氧化物直接损伤宿主细胞，还可扰乱患儿免疫系统功能、改变T 细胞亚群构成及促进炎症级联反应加重患儿病情[2]，但是其具体病理机制尚未完全清楚，亟待深入研究。microRNA 是长度约20 个核苷酸的非编码小核糖核酸，其可调节机体内细胞的分化、增殖及调亡等众多生命过程，其中的microRNA-21（miR-21）及microRNA-221（miR-221）在调节机体免疫系统及激活炎症反应的过程中发挥着重要作用[3-4]，但是关于MPP 患儿体内miR-21 和miR-221 表达的报道很少。本研究拟分析MPP 患儿血清miR-21 和miR-221 的水平变化及其与炎症因子、T 淋巴细胞亚群的关系，以期为MPP 的诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1月—2019年1月在邯郸市中心医院就诊的120 例MPP 患儿为研究对象（MPP 组）。其中，男性63 例，女性57 例；年龄3～8 岁，平均（5.32±1.35）岁。纳入标准：①MPP 的诊断符合《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识（2015 版）》相关标准[5]；②无心肌炎、小儿哮喘及心包炎等疾病。排除标准：①14 d 内接受过抗感染治疗；②细菌感染等呼吸系统疾病；③先天性免疫缺陷疾病。另选取本院同期体检的健康儿童100 例作为对照组（CON 组）。其中，男性55 例，女性45 例；年龄4～8 岁，平均（5.68±1.47）岁。两组年龄和性别构成比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准同意，所有儿童家属签署知情同意书。

1.2 研究方法

①血标本采集：清晨采集入组对象空腹静脉血2 ml（3 份），一份加入淋巴细胞分离液分离，分离后6 h 内检测T 淋巴细胞亚群，一份加入RNA 提取剂，置于-80℃冷藏器中备用，一份离心机3 000 r/min（离心半径14 cm）离心10 min，取上清液置于-80℃冷冻保存备用。②miR-21 和miR-221 的检测：实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR），先经RNA 提取试剂盒（德国QLAGEN 公司）提取总RNA 及检测，经逆转录cDNA 试剂盒（北京天根生化科技有限公司）合成cDNA，再使用qRT-PCR 扩增仪（美国AB公司）对miR-21、miR-221 及内参引物U6进行扩增。扩增程序为：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，50℃退火1 min，75℃延伸1 min，一共进行45个循环。miR-21引物：正向5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTA TCAGACTGAT-3'，反向5'-ACTGGTGTCGTGGAGTC G-3'；miR-221引物：正向5'-CAGCATACATGATTCC TTGTGA-3'，反向5'-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3'；内参引物U6：正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。使 用2-ΔΔCt（ΔCt =样品Ct 均值-内参Ct 均值）法对miR-21和miR-221 水平进行定量分析。③T 淋巴细胞亚群的检测：采用流式细胞术进行检测，血样经红细胞裂解液裂解→PBS 清洗液清洗→稀释至每毫升1×106个细胞，最后经流式细胞仪（美国BD 公司）收集并分析CD3+、CD4+、CD8+，并计算CD4+/CD8+。④炎症因子的检测：血清样本解冻后使用880 型酶标仪（德国拜发仪器公司），采用酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）水平，试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（ˉ±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验。相关分析用Pearson 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-21、miR-221水平的比较

两组血清miR-21、miR-221 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MPP 组高于CON 组。见表1。

表1 两组血清miR-21、miR-221水平的比较（±s）

表1 两组血清miR-21、miR-221水平的比较（±s）

组别MPP组CON组t 值P 值n 120 100 miR-21 2.74±0.58 1.08±0.72 18.939 0.000 miR-221 3.24±1.17 1.19±0.67 15.525 0.000

2.2 两组外周血T淋巴细胞亚群的比较

两组外周血T 淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MPP 组低于CON 组。见表2。

表2 两组外周血T淋巴细胞亚群的比较（±s）

表2 两组外周血T淋巴细胞亚群的比较（±s）

组别MPP组CON组t 值P 值n 120 100 CD3+/%36.29±7.44 43.56±8.14 6.914 0.000 CD4+/%17.52±6.15 28.15±6.57 12.375 0.000 CD8+/%18.43±5.59 24.51±6.49 7.465 0.000 CD4+/CD8+0.95±0.27 1.15±0.23 5.847 0.000

2.3 两组炎症因子的比较

两组炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MPP 组高于CON 组。见表3。

表3 两组炎症因子的比较 （ng/L, x±s）

2.4 MPP 组患儿血清miR-21、miR-221 水平与T淋巴细胞亚群的相关性

MPP 组血清中miR-21 和miR-221 与患者外周血中CD3+（r=-0.494 和-0.656，P=0.037 和0.014）、CD4+（r=-0.621 和-0.554，P=0.015 和0.031）、CD8+（r=-0.772 和-0.476，P=0.003 和0.043）、CD4+/CD8+（r=-0.545 和-0.660，P=0.023 和0.014）均呈负相关。见图1。

图1 MPP组患儿血清miR-21、miR-221水平与T淋巴细胞亚群的相关趋势图

2.5 MPP组患儿血清miR-21、miR-221水平与炎症因子的相关性

MPP 组血清中miR-21 和miR-221 与IL-6 （r=0.530 和0.598，P=0.035 和0.029）、IL-8（r=0.665和0.614，P=0.012 和0.017）、TNF-α（r=0.787 和0.619，P=0.000 和0.015）均呈正相关。见图2。

图2 MPP组患儿血清miR-21、miR-221水平与炎症因子的相关趋势图

3 讨论

MPP 多发于5～15 岁的儿童，疾病早期临床中常表现为严重的干咳、头痛及不规律发热，病情严重时患儿免疫系统紊乱、全身炎症反应加重，导致心、肝、脑等重要器官损伤，严重威胁患儿生命健康，目前MPP 的发病机制尚未完全明确，根据既往的研究报道其发病的主要病理基础是免疫系统的损伤和过度炎症应答反应[6]，因此明确患儿体内免疫损伤机制及炎症反应发生机制是重中之重。

miRNA 一种对真核细胞基因表达有着调控作用的单链小RNA 片段，其参与细胞的生长发育、分化调亡等过程，同时也与多种疾病的发生、发展密切相关[7]。miR-21 参与了多种疾病的发生、发展，其可通过Akt 信号通路抑制抑癌基因PTEN 的表达而引发各类肿瘤，与原肌球蛋白mRNA 末端结合上调原肌球蛋白的表达可引发动脉粥样硬化，还可以下调免疫调控因子FasL 的表达而促进肿瘤细胞免疫逃逸[8]。miR-21 对炎症的调控可能是通过对EGFR、NTF3、MAP3K1等基因的调节间接调控MAPK 通路，进而调节炎症反应，其在单核细胞、巨噬细胞、炎症细胞及T 淋巴细胞中均有表达，参与了冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、血管内皮细胞损伤等众多慢性炎症疾病[9]。林岚等[10]的研究发现老年癫痫患者血清中miR-21 表达上调，且与炎症因子IL-2、TNF-α 和CD3+及CD4+T 淋巴细胞呈正相关，这也提示了miR-21 参与机体炎症反应及免疫水平的调节。miR-221 可通过促进增殖、迁移、表皮间转化及G1/S 期转化诱导肿瘤细胞的恶性表达，还可以通过促进血管平滑肌细胞的增殖引发血管损伤、重塑，导致动脉粥样硬化的形成[11]。同时，miR-221 是目前与MPP 免疫紊乱及过度炎症反应关系最为密切的一种miRNA，其可转录调节炎症相关因子的表达，主要是通过调节脂联素受体1 来调节血管内皮细胞的炎症反应[12]。王飞等[13]的研究就发现哮喘患儿及小鼠的肺组织中miR-221 水平明显上升，且哮喘小鼠肺组织中的炎症因子（IL-1、IL-4） 水平显著上升，而使用miR-221 抑制剂后炎症因子水平显著下降，这也提示miR-221 参与炎症反应的调控。本研结果显示MPP 患儿miR-21 和miR-221 水平明显高于健康儿童，且MPP 患儿血清中的炎症因子水平显著升高，而T 淋巴细胞亚群显著下降，该结果提示MPP 患儿体内免疫功能紊乱及过度炎症反应可能与miR-21和miR-221 的表达水平升高有关。

T 淋巴细胞是机体细胞免疫的效应细胞，正常情况下其数量保持动态平衡。CD3+T 淋巴细胞是成熟细胞，其代表T 细胞的活化比例。CD4+T 细胞是辅助细胞（Th1/2），Th1 细胞主要分泌IL-2 和TNF-β，Th2 主要分泌IL-4、IL-6、IL-8、IL-10 及TNF-α，正常情况下Th1 和Th2 维持动态平衡，当机体感染病原微生物时，入侵抗原可刺激T 细胞产生特异性应答，两者动态平衡被打破，机体会出现免疫功能紊乱及炎症介质大量释放[14]。CD8+T 细胞是抑制性辅助细胞，主要功能是直接杀伤外来抗原。CD4+/CD8+代表机体总体免疫功能，其值下降表示机体免疫功能受到抑制[15]。本研究结果显示MPP 患儿CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+明显下降，这可能是肺炎支原体感染患儿后，通过抗原呈递及其他生物学机制引起免疫功能紊乱，机体成熟T 淋巴细胞较少，细胞亚群失衡。

机体分泌炎症因子的初衷是防御外来病原微生物的入侵，但其过度释放会导致机体损伤。TNF-α 由激活的单核、巨噬及T 细胞产生，可调节机体适应性免疫、促使细胞凋亡，但有研究[16]显示TNF-α 分泌过量可促进炎症反应、损伤器官。IL-6由T 细胞及内皮细胞产生，可有效刺激B 细胞的分化，在机体急性期发挥重要作用，但过量的IL-6可诱导胸腺细胞分泌大量炎症因子损伤组织[17]。IL-8 由活化的巨噬细胞、上皮细胞及T 淋巴细胞产生，可以有效地抑制机体免疫因子的释放以控制免疫应答，但二者过量释放其作用减弱甚至起到促进作用[18]。研究结果显示MPP 患儿血清各炎症因子的水平明显升高，这也与DONG 等[19]的研究相符，提示MPP 患儿体内炎症因子过度释放，炎症反应较重，其可能是患者组织损伤的主要机制之一。

此外，本相关性研究结果显示MPP 组血清中miR-21 和miR-221 与患儿外周血中的各T 淋巴细胞亚群及CD4+/CD8+呈负相关，而与各炎症因子呈正相关，这提示miR-21 和miR-221 可能通过调控MPP 患者免疫系统及炎症因子的释放引起组织病理学损伤。通过本研究结果及既往文献的报道，高水平miR-21 和miR-221 对MPP 影响的机制可能有两点：①通过MAPK 及MyD88 等通路导致患儿免疫功能紊乱，成熟T 淋巴细胞减少进而降低机体总体免疫功能、Th1/Th2 失衡引起大量炎症因子释放；②直接刺激炎症细胞分泌大量的炎症因子进而引起机体防御性炎症反应过度。这也提示临床可通过检测二者的水平变化以评估MMP 患儿的免疫状态和炎症反应程度，并为患儿临床诊断及治疗方案的制订提供一定帮助。当然，本研究属于单中心研究，可能代表不了所有MPP 患儿，未来需要设计更多随机对照研究来验证此结论。

综上所述，MPP 患儿血清miR-21 和miR-221的水平明显升高，且与患者T 淋巴细胞亚群水平降低、炎症因子水平升高相关，及时监测二者水平变化可以为MPP 的诊治提供帮助。