以蝗虫翅为模板的仿生高分子膜血液相容性研究

房 岩，孙 刚，邱泽奎，蓝 蓝，龙 彪，黄俊江

(1.三明学院 资源与化工学院 药用植物开发利用福建省高校工程研究中心 福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室，三明 365004；2.长春师范大学 生命科学学院，长春 130032；3.福建农林大学 生命科学学院，福州 350002)

生物医用材料越来越多地用于人工器官、再生组织诱导、药物送达释放、外科修复、治疗诊断等领域[1]，而优良的血液相容性是生物医用材料植入人体的基本要求。血液相容性是指生物材料表面对血栓形成的抑制能力和血液正常生理功能的保持能力，包括降低血小板黏附和激活、减小红细胞溶血率、延长凝血时间等[2]。伴随着组织工程学的深入研究，人们追求更加稳定、性能更加优异、免疫原性更低、更加耐生物老化、与人体环境更加一致的生物材料，将人工智能、纳米技术、仿生原理、药物控释技术相结合，向智能化、生命化、多功能化的方向发展[3]。经过数十亿年的生命进化和协同演化，生命体形成具有特殊微纳结构、化学成分、浸润性、黏附性和光学特性的天然表面[4-5]。以生物体表为模板，设计不同表面结构的新型医用材料，成为近年来国内外的研究热点[6-7]。本文在前期工作的基础上[8-10]，制备具有昆虫翅微观结构和良好血液相容性的高分子仿生膜，探讨表面粗糙形貌与血液相容性之间的作用关系，为抗凝血特种功能性生物材料的选择、优化、控制及制备提供可参考的研究方法和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取中华稻蝗(Oxyachinensis)、棉蝗(Chondracrisrosearosea)和东亚飞蝗(Locustamigratoriamanilensis)等3种昆虫翅为模板，使用聚乙烯醇(PVA，国药集团化学试剂有限公司，中国)、PDMS(Dow Corning 184，美国)为基材。剪取洗净干燥的翅和PDMS膜(3 mm×3 mm)备用。有机试剂均为分析纯(AR)。

1.2 方法

1.2.1 仿生膜的制备

按质量比1∶10称取PVA与蒸馏水，恒温水浴(90 ℃)，至溶解，磁力搅拌2 h(90 ℃，1 500 r/min)，静置至无气泡。将蝗虫翅粘于载玻片上，PVA水溶液均匀涂在翅表，室温静置24 h，得到具有翅反结构的PVA模板。将PDMS预聚物A与固化剂B按质量比1∶10混合搅拌，至无气泡。涂抹于PVA模板，静置20 min，干燥2 h(120 ℃)，得到具有翅结构的PDMS仿生膜。同步制作无翅结构的光滑PDMS膜作为对照(CK)。

1.2.2 血小板黏附性的测定

将PDMS对照膜和仿生膜分别置于生理盐水中清洗3次，PBS缓冲液中浸泡2 h；取10 mL新鲜抗凝人血进行离心(1 500 r/min，10 min)，将仿生膜置于上层的富血小板血浆中进行恒温孵化(37 ℃，2 h)。吸去富血小板血浆，用PBS缓冲液清洗3次，用2.5%戊二醛固定(室温，2 h)，按一定浓度梯度乙醇/水溶液脱水(30%、50%、70%、90%和100%，30 min/次)。临界点干燥，喷金处理，扫描电子显微镜(日立Su8010，日本)SEM下观察血小板形态，计算其密度。

1.2.3 溶血率的测定

取4 mL新鲜抗凝人血用5 mL生理盐水稀释。仿生膜在10 mL生理盐水中孵化(37 ℃恒温水浴，30 min)。加入0.2 mL稀释血液，混合后恒温(37 ℃，60 min)孵化。吸取适量液体离心(1 500 r/min，5 min)。取上清液，用紫外可见分光光度计(北京普析TU-1800，中国)测定波长540 nm处的吸光度。阳性对照组用10 mL蒸馏水加入0.2 mL稀释血液；阴性对照组用10 mL 0.9% NaCl溶液加入0.2 mL稀释血液，测定方法、保存条件与PDMS仿生膜相同。按下式计算溶血率：

溶血率=(Dt-Dnc)/(Dpc-Dnc)×100%

(1)

式中Dt：样品的吸光度值；Dpc：阳性对照组的吸光度值；Dnc：阴性对照组的吸光度值。

1.2.4 动态凝血时间的测定

抽取6 mL新鲜血液，在样品表面滴0.05 mL后静置，设置5个时间点(10、20、30、40和50 min)，把样品移至烧杯并加入25 mL蒸馏水，均匀混合，用紫外可见分光光度计测定波长540 nm处的吸光度。

1.2.5 微观结构的表征

用导电胶带分别将蝗虫翅和仿生膜固定于铜质圆柱形样品台，使用小型离子溅射仪(日立E-1045，日本)对样品表面喷金处理(厚度约20 nm)，置于SEM下观察和表征。

1.2.6 浸润性的测定

使用光学接触角测量仪(Data Physics OCA20，德国)分别测量蒸馏水、血液在蝗虫翅及仿生膜表面的接触角。液滴体积为3 μL，每个样品测量5次，取平均值。

1.2.7 数据处理与统计分析

血样样本数量n=5，结果以均值±标准差表示。采用Origin 8.5.1软件进行单样本t检验、双样本t检验和差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 表面微观结构

3种蝗虫翅表面具有相似的微观粗糙单元，均为乳突状。PDMS仿生膜成功复制了翅表面的形貌结构(图1)。

(a)中华稻蝗O. chinensis蝗虫翅；(b)棉蝗C. rosea rosea蝗虫翅；(c)东亚飞蝗L. migratoria manilensis蝗虫翅；(d)中华稻蝗仿生膜；(e)棉蝗仿生膜；(f)东亚飞蝗仿生膜。图1 蝗虫翅及仿生膜表面微观结构(SEM)Figure 1 The surface microstructure of locust wings and biomimetic films

采用常用的两种指数评价表面粗糙度[11-12]：d/l和d/(d+l)，其中，d为乳突直径，l为乳突间距。指数(东亚飞蝗<中华稻蝗<棉蝗)越小，表示表面粗糙度(东亚飞蝗>中华稻蝗>棉蝗)越大(表1)。微观粗糙形貌构成了表面复合浸润性和血液相容性的结构基础。

表1 PDMS仿生膜与对照膜的微观结构参数及复合浸润性Table 1 Microstructural parameters and complex wettability of the biomimetic and smooth PDMS films

2.2 表面浸润性

仿生膜表面具有复合浸润性，符合Cassie接触模式，水滴接触角(θ水)为141.3°～147.6°，为超疏水表面；血液接触角(θ血)为119.8°～126.3°，显示出较强的疏血性(表1)。其中，东亚飞蝗翅仿生膜的疏水性和疏血性最强，接触角分别高于对照41.2%和32.1%。在蝗虫翅表面，除了微米级突起还具有纳米级结构，该多级结构是仿生膜疏水性和疏血性增强的主要因素。随着微米级乳突直径与间距比值的减小，表面粗糙度增大，接触角随之增加，接触角与该比值呈负相关变化趋势。

2.3 血小板黏附

血小板黏附是评价生物医用材料血液相容性的重要指标。对照组表面黏附了大量活化的血小板以及大块的纤维状物质，血小板数量较多且已完全被激活，发生形变、团聚、黏附和凝血现象[图2(a)]。在以中华稻蝗、棉蝗和东亚飞蝗翅为模板的仿生膜表面，血小板黏附量分别为3.06×104、2.83×104和0.95×104个/cm2，明显低于对照组(10.89×104个/cm2)，而且血小板的形状基本得以保持。其中，中华稻蝗、棉蝗翅仿生膜表面的血小板部分出现不规则伪足和变形，但基本结构仍清晰可辨[图2(b)和(c)]。东亚飞蝗翅仿生膜表面的血小板数量最低，仅为对照组的8.7%，同时形态保持完好，具有较好的抗凝血性[图2(d)]。

(a)对照；(b)中华稻蝗；(c)棉蝗；(d)东亚飞蝗。图2 PDMS膜表面的血小板黏附状态Figure 2 The adhesion condition of platelet on the PDMS films

2.4 溶血率

溶血率表征材料对红细胞造成破坏的程度，对医用材料的筛选具有特殊意义[13]。阳性对照组的吸光度值(Dpc)为1.225 L/(g·cm)，阴性对照组的吸光度值(Dnc)为0.001 L/(g·cm)，将样品的吸光度值(Dt)代入公式(1)计算溶血率，PDMS仿生膜表面溶血率均<5%，符合我国医用高分子材料的溶血率标准，血液相容性能够达到机体环境的要求，可认为材料本身对红细胞没有破坏作用[14]。将仿生膜、对照膜表面溶血率分别与5%的国家标准进行单样本t检验，所得P值设为P1值，3种仿生膜P1值均小于0.05，表明溶血率显著优于国家医用材料标准；将仿生膜表面溶血率分别与对照膜表面溶血率进行单样本t检验，所得P值设为P2值，东亚飞蝗和中华稻蝗的P2值均小于0.05，表明这两种仿生膜表面溶血率显著优于对照膜表面，对凝血反应和微血栓形成具有有效的抑制作用(表2)。

表2 PDMS膜表面吸光度、溶血率及P值Table 2 Absorbance,hemolysis rate and P values of the PDMS films

2.5 动态凝血时间

动态凝血时间可检测内源性凝血因子的激活程度，进而判断生物材料的抗凝血性能。对同一时间点，吸光度越大，表明溶液中血红蛋白浓度越高，血液在材料表面凝固性越弱，凝血时间越长，材料的血液相容性越好。仿生膜的吸光度高于对照组，除棉蝗50 min时间节点外，与对照组吸光度之间均有显著差异(双样本t检验，P<0.05)，显示出更加优异的血液相容性。在10～30 min内，对照组和仿生膜吸光度均快速下降，最高幅度达58%，说明前30 min内源性因子被激活的程度较高。在40、50 min两个时间节点，中华稻蝗和棉蝗仿生膜吸光度仍下降较快，东亚飞蝗仿生膜吸光度虽亦呈向下趋势，但相对平缓。在5个时间节点，东亚飞蝗与中华稻蝗、东亚飞蝗与棉蝗仿生膜吸光度之间均有显著差异(P<0.05)，表明其抗凝血性和血液相容性均优于中华稻蝗和棉蝗仿生膜(表3)。

表3 PDMS膜表面的动态凝血过程Table 3 Dynamic coagulation course of blood on the surface of PDMS films

3 讨论与结论

良好的抗凝血生物材料不仅要具有出色的加工和物化性能，而且要具有优异的血液相容性和组织相容性。生物医用材料与血液的相互作用受到多种因素的影响，如表面形貌、化学组成、浸润性、血液成分、血流动力学特征等[15]。材料表面微观形貌对血细胞的位向、附着、增殖以及蛋白质的合成、分泌等具有重要影响，是血液相容性的决定因素之一。传统理论认为，表面粗糙度越高的材料暴露在血液的面积越大，凝血的可能性也就越大。但根据非光滑耦合理论[16]，一定范围内的粗糙度可优化表面的复合浸润性，增大仿生膜的水滴接触角与血液接触角，减少血液中各种成分与材料表面的接触机会以及对细胞膜的损伤，达到抗溶血和抗凝血的效果[17]。

正常情况下的血液流动为层流状态，从血管轴心到血管壁，血液流动方向一致，但遇到粗糙表面时，层流状态可能被打乱，变为湍流。微纳双重结构减小了血细胞与材料表面的有效接触面积，降低了血细胞被捕获的概率，产生特殊的细胞效应性，有利于抑制血栓的形成[18]。血管内壁的纳米沟槽一方面抑制了血小板的黏附，另一方面优化了流体动力学，降低了血液流动的紊乱性和血小板激活的概率[19]。

以蝗虫翅为模板制备了PDMS仿生膜，成功复制了翅表面的形貌结构，表现出较强的疏水性(水滴接触角141.3°～147.6°)和疏血性(血液接触角119.8°～126.3°)。微纳多级结构是仿生膜疏水性和疏血性增强的主要因素。根据血小板黏附、溶血率、动态凝血时间等指标，仿生膜表面具有较好的血液相容性。对照膜表面黏附了大量活化的血小板以及大块的纤维状物质，血小板数量较多且已完全被激活，发生形变、团聚、黏附和凝血现象。而在以中华稻蝗、棉蝗和东亚飞蝗翅为模板的仿生膜表面，血小板黏附量明显低于对照组，而且血小板的形状基本得以保持。其中，东亚飞蝗翅仿生膜表面的血小板数量最低，仅为对照组的8.7%，同时形态完好，未被激活，具有较好的抗凝血性。仿生膜表面溶血率均<5%，符合我国医用高分子材料的溶血率标准。与对照膜相比，仿生膜的动态凝血过程更加平缓，具有更长的动态凝血时间。在3种仿生膜中，东亚飞蝗的抗凝血性能和血液相容性均优于中华稻蝗和棉蝗仿生膜，对凝血反应和微血栓形成具有显著的抑制效应，这是由于东亚飞蝗翅具有更大的表面粗糙度和更高的疏水性、疏血性，不利于血细胞的黏附和铺展。具有大比表面积和高孔隙率的微纳米表面可以促进血细胞与微结构单元之间的相互作用，并且微纳米效应阻止了细胞的机械损伤。这与其他学者的研究结果一致[20]。构建具有特殊浸润性的功能材料已成为各国学者关注的重点领域，其中仿生材料是近年来功能材料研究的热点课题[21]。不同尺寸参数的表面形貌和浸润性是研究其血液相容性的基础。揭示这些因素与血液相容性之间的作用关系，可为与人类健康密切相关的新型医用工程材料的选择、制备及控制提供有利依据。