结核分枝杆菌rpoB基因和突变检测技术在结核性脑膜炎中的诊断价值

李 静，焦向阳，白广红，仵倩红

(陕西省结核病防治院检验科，陕西 西安 710100)

结核性脑膜炎(tuberculousmeningitis，TBM)是临床上一种常见的肺外结核，被认为是最严重的肺外结核(EPTB)，约占EPTB病例中的5%～10%[1]，死亡率高达67.2%[2]，该病多发于青壮年，发病无明显季节性[3-4]且发病隐匿，常继发于其他系统的感染，大多为结核分枝杆菌经血循环进入颅内而发病。临床表现缺乏特异性，病原学阳性检出率很低[5]，所以早期诊断极为困难。早期快速的实验室诊断方法能够为患者的治疗和预后提供较大帮助。由于条件限制，对于基层而言，实验室诊断TBM常用的检测方法是：抗酸杆菌(AFB)涂片和分枝杆菌培养。AFB涂片虽然快速、价低，但是脑脊液标本阳性检出率及敏感性都很低，而分枝杆菌培养周期长、不能满足临床早期、快速诊治的需求，故寻求一种新的快速、准确且高敏感度和高特异度的实验室诊断方法成为TBM检测工作的重要目标。GeneXpert是以全自动半巢式实时PCR技术为基础，以rpoB基因为靶基因，在2 h内同时快速检测结核分枝杆菌和利福平(rifampin,RIF)耐药。2013年GeneXpert检测作为新型分子诊断技术被WHO推荐用于肺外结核的诊断[6-7]。但目前GeneXpert用于脑脊液样本的诊断价值说法不一，本研究中，通过对比分析AFB涂片、MGIT960培养、GeneXpert检测对TBM的诊断效能，进一步评估GeneXpert检测对TBM的诊断价值。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集2019年1月至2020年6月陕西省结核病防治院收治的同时采用AFB涂片、MGIT960培养和GeneXpert检测的142例疑似TBM患者，其中确诊TBM组中男52例(63.4%)、女30例(36.6%)；年龄12～76岁，中位年龄为32(25,47)；非TBM组中男33例(55.0%)、女27例(45.0%)，年龄14～81岁，中位年龄为30(25,56)。所有患者临床确诊资料均来源于临床原始病例记录，且通过本院伦理委员会审核，获得所有患者知情同意。

1.2 诊断依据

参照2010年国际TBM协作组[8]制定的评分标准，按此标准，临床诊断为TBM患者共82例(包括确诊的TBM 46例，很可能的TBM 26例，可能的TBM 10例)；非TBM组60例患者(包括临床评分<6分的疑似结核性脑膜炎患者38例，化脓性脑膜炎15例，病毒性脑膜炎7例)。

1.3 主要试剂和仪器

抗酸染色试剂为实验室自配萋尼染色试剂；MGIT960检测系统所用的培养仪及试剂均由美国BD公司提供；GeneXpert检测系统及配套试剂盒均购于美国Cepheid公司。

1.4 实验室检测方法

按照无菌采集标本的要求收集留取脑脊液≥5 mL，每份标本均进行AFB涂片、MGIT960培养和GeneXpert检测。

1.4.1 AFB涂片 严格按照《结核病实验室检验规程》[9]操作。将脑脊液标本用一次性吸管吸取少许于洁净玻片上涂片，大小约为1 cm×2 cm、干燥后萋尼染色镜检，按照检验规程报告结果。

1.4.2 MGIT960培养 严格按照《结核病实验室检验规程》[9]操作。取0.5 mL脑脊液标本接种至MGIT960培养管中，加入0.8 mL营养添加剂(OADC)和杂菌抑制剂(PANTA)的混合液，严格按照说明进行操作。将接种好的MGIT960培养管放入MGIT960系统中孵育，仪器对分枝杆菌的生长进行自动监测。仪器报阳后采用结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(MPB64)进行结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步鉴定[10]。

1.4.3 GeneXpert 严格按照操作说明书进行检验。将1 mL脑脊液标本与2 mL GeneXpert系统前处理液混合，拧紧瓶盖，涡旋振荡15 s，室温静置15 min，使标本充分液化，将消化后的2 mL样品用无菌吸管吸入GeneXpert系统测试盒中，上机检测，约2 h报告结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。以临床确诊患者为参考标准，评价AFB涂片、MGIT960培养、GeneXpert技术的敏感度、特异度、符合率、阳性预测值和阴性预测值。组间率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检测方法对TBM的阳性检出率

回顾性分析临床确诊142例的住院患者，其中临床确诊为结核性脑膜炎有(TBM组)82例(82/142,57.7%),其中AFB涂片检出阳性3例，阴性79例，阳性检出率为3.7%(3/82)；MGIT960培养检出阳性20例，阴性62例，阳性检出率为24.4%(20/82)；Xpert分子检出阳性33例，阴性49例，阳性检出率为40.2%(33/82)。

2.2 不同检测方法诊断TBM的检测效能

以临床确诊患者为标准，AFB涂片、MGIT960培养、GeneXpert对TBM的检测效能见表1。脑脊液标本AFB涂片的敏感度低于MGIT960培养(χ2=14.615，P<0.05)，GeneXpert检测的敏感度高于AFB涂片的敏感度(χ2=32.031，P<0.05)和MGIT960培养(χ2=4.711，P<0.05)。

表1 不同检测方法对TBM诊断效能分析

3 讨论

TBM是神经系统结核病最常见的类型，由结核分枝杆菌侵入蛛网膜下隙引起软脑膜、蛛网膜病变进而累及脑血管，部分可累及脑实质，在我国为常见病，致残率及死亡率高[11]。由于TBM早期临床症状不明显和缺乏特异性常常导致诊断的延误，从而影响患者的生存质量并危及生命。传统的细菌学检测方法仍是结核病诊断的“金标准”，然而与痰标本不同，脑脊液标本实验室检查中AFB涂片查找抗酸杆菌的阳性率很低，而分枝杆菌培养周期长、不能满足临床早期、快速、准确诊治的需求，故寻求一种新的快速、准确且高敏感度和高特异度的诊断方法成为TBM检测工作的重要目标。而GeneXpert作为新型分子诊断技术，其在肺外结核中的诊断价值已被多项研究评估[12-14]，认为应用GeneXpert检测胸腔积液、骨关节结核部位脓液标本具有较高的敏感度和检测方法的优越性，被认为可用于肺外结核的各种类型的临床标本检测的确证性诊断试验，但对于脑脊液的诊断敏感度还存在争议[15-17]，需要进行更深入的研究[18]。2019年郑立恒，等[19]以临床诊断为诊断标准比较了AFB涂片和GeneXpert检测方法在TBM中的诊断敏感度，分别为4.44%(2/45)和35.56%(16/45)。郑会强，等[20]以临床诊断为标准比较了MGIT960培养和GeneXpert检测方法在TBM中的诊断敏感度，分别为19.7%(14/71)和42.3%(30/71)。本研究中以临床确诊为诊断标准比较了AFB涂片、MGIT960培养和GeneXpert3种检测方法在TBM中的诊断敏感度，分别为3.7%(3/82；95%CI：0.4%～7.7%)，24.4%(20/82；95%CI：15.1%～33.7%)和40.2%(33/82；95%CI：29.6%～50.9%)。相比于上面提到的研究，本研究中AFB涂片敏感度较低，分析原因主要有以下2点：①脑脊液标本含菌量本就较低，而由于脑脊液所处位置特殊，每次所留取样本量较少，含菌量更少，使得AFB涂片阳性检出率更低；②本研究中AFB涂片法的脑脊液标本染色具体实验操作方法同痰液，冷染0.5 h，而脑脊液标本相比痰液黏附率本身就很低[21]，冷染时间长，固定效果减弱冲片时更容易脱落，且AFB涂片需抗酸杆菌达到5×103～1×104个/mL的浓度才能检测出阳性结果，涂片样本量难以达到检测需求故而阳性检出率更低。MGIT960培养的敏感度较高的可能原因为：①本研究入选TBM患者选择严格；②MGIT960培养对环境要求极高，操作较为复杂，但所有操作人员均受到严格的训练，操作规范。

本研究中，GeneXpert检测的敏感度明显高于其他两种检测方法，其中MGIT960培养和GeneXpert的检测阳性者仅有10例为同时阳性，重叠比例较低，这可能的原因为：本研究中大多TBM患者在留取样本之前已服用抗结核药物治疗，而结核菌培养主要检测的是活的结核分枝杆菌，GeneXpert主要检测的是结核分枝杆菌的DNA，抗结核药物会影响结核分枝杆菌的培养阳性检出率，且MGIT960培养与GeneXpert的细菌浓度阳性阈值检测限也不同(前者为10～100条/mL，后者为131条/mL)。在这3种检测方法中GeneXpert检测有明显的优点：操作简便、快速、2 h可在患者标本中直接检测结核分枝杆菌，敏感度高，对TBM的早期诊断、治疗和预后有很大的帮助，且能检测利福平是否耐药。

本研究也存在一定的局限性，①虽然统计了一年半的疑似病例，但最终纳入的TBM患者样本量仍然很少；②由于实验室检测条件有限，无法对不相符的检测结果进行深入研究。

综上所述，AFB涂片检测TBM的阳性率极低，MGIT960培养周期较长，不适于TBM的早期诊断。GeneXpert检测的敏感度明显高于传统的AFB涂片和结核菌培养，且生物安全风险性极低，对TBM早期诊断具有良好的指导意义。在临床工作中优先选择GeneXpert检测用于诊断，帮助TBM患者早期诊断，减少漏诊及误诊，降低死亡率。