离子交换法分离L-丝氨酸的试验研究
2021-10-23郑桂花李世尧张文浩
郑桂花,李世尧,张 婷,崔 雄,张文浩,孙 静,邱 诚
(1.成都工业学院材料与环境工程学院,成都 611730;2.华中科技大学环境科学与工程学院,武汉 430074)
氨基酸分离方法主要有沉淀剂分离法、离子交换法、膜分离法、吸附法、萃取法等。沉淀法包括特殊试剂沉淀法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法。特殊试剂沉淀法是最早应用于混合氨基酸分离的方法之一,精氨酸和亮氨酸的特殊沉淀法分离工艺已较为成熟[1]。沉淀法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高、选择性强的优点,但是也有沉淀剂回收困难、排放废液量大、环境污染严重等问题,因此沉淀法已逐渐被其他分离方法取代。吸附法选择性相对较差、收率低,特别是一些无机吸附剂的性能不稳定、不能连续操作、劳动强度大,尤其是活性炭还影响环境卫生。近年来逐渐发展的新型分离技术有超临界CO2萃取技术、超滤和纳滤技术以及液膜技术等,这些新开发的技术取得了很大进展,但也存在工艺不够成熟、设备精密度不高、难以去除萃取液的毒性、有机溶剂用量大、废弃溶剂难以回收、生产成本高等诸多问题,在一定程度上限制了其大规模应用。
离子交换法是氨基酸工业中应用比较广泛的一种分离纯化方法,主要根据离子交换树脂对不同氨基酸吸附能力的差异实现对混合溶液中氨基酸组分或单一组分的分离。根据报道,目前已有很多成功运用离子交换方法分离氨基酸的研究,如余讳等[2]采用732阳离子交换树脂,从发酵液中分离纯化出L-亮氨酸,总提取率达71.28%;Simon等[3,4]利用离子交换热参数泵成功从水解液和制革废液中分离浓缩出氨基酸;此外,应用离子交换方法实现分离的氨基酸还有精氨酸(Arg)[5,6]、赖氨酸(Lys)[7]、异亮氨酸(Ile)[8]、酪氨酸(Tyr)[9]、亮氨酸(Leu)[2]、丙氨酸(Ala)[10]、脯氨酸(Pro)[11]、组氨酸(His)[12]、谷氨酸(Glu)[13]、苯丙氨酸(Phe)[1]等。酶法合成L-丝氨酸试验反应结束后,酶反应液中可能含有甘氨酸和L-丝氨酸,由于甘氨酸和丝氨酸性质相似,等电点接近,溶解度也相差不大,所以二者一直是氨基酸分离领域的难点,基于离子交换法设备要求简单、易于操作、分离成本低廉、处理量大以及便于大规模进行工业化生产等诸多优势,本研究选用DIAION PA312阴离子交换树脂对L-丝氨酸进行分离纯化,以期能够为相关的实践提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
DIAION PA312树脂购于三菱化学股份有限公司,D301R阴离子交换树脂和AB-8大孔吸附树脂均购于天津南开合成科技有限公司,201×7阴离子交换树脂购于上海劲凯树脂有限公司,TEA购于国药集团化学试剂有限公司,衍生化试剂PITC(>98%)购于阿拉丁试剂有限公司,乙腈和甲醇由美国Tedia试剂公司生产,甲酸(98%~100%)来自天津光复精细化工研究所。除甲醇和乙腈为色谱纯外,其余试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
RE-52A旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;Agilent 1200谱作站,美国安捷伦科技公司;YM-50高压蒸汽灭菌锅,上海三申医疗器械有限公司;ZHWY-2102恒温培养箱,上海智城分析仪器有限公司;DZF-6020MBE真空干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;101A-1BY鼓风恒温干燥箱,杭州蓝天化验仪器有限公司;SHB-3循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;Agilent Eclipse plus C18色谱柱,美国Sigma-Aldrich公司;Agilent1100LC/MSD液质联用仪,美国安捷伦科技公司。
1.3 试验方法
1.3.1 离子交换树脂的预处理
1)大孔吸附性树脂的预处理:将树脂除杂、过筛,用一定量去离子水漂洗除去浮粒;然后用95%乙醇浸泡24 h,再用小流量去离子水淋洗,洗至流出液不浑浊为止;最后用2~3倍树脂体积的1 mol/L HCl溶液浸泡3 h,水洗至流出液接近中性,再用2~4倍树脂体积的2 mol/L NaOH溶液浸泡3 h,去离子水洗至中性。
2)阴离子交换树脂的预处理:先用自来水浸泡2 h,使其充分膨胀,去除树脂中的细小颗粒,用去离子水洗至pH为5~6;然后用2 mol/L NaOH溶液浸泡6 h,用去离子水洗去碱液至pH为7.0;再用2 mol/L的HCl溶液连续浸泡6 h,用去离子水洗去酸液至pH为5.5±0.5;最后再次用2 mol/L NaOH溶液转型处理浸泡6 h,用去离子水洗至pH为7.0,以备使用。
1.3.2 吸附量、吸附率及L-丝氨酸含量的测定方法
1)吸附量和吸附率的测定:准确称取已经处理好的201×7、AB-8、D301R、DAION PA312树脂各2 g,置于150 mL的三角瓶中,依次加入20 mL的浓度为10 g/L的L-丝氨酸溶液,于30℃,100 r/min的恒温摇床中连续振荡7 h,比较这4种树脂的静态吸附容量。离子交换树脂的吸附量即交换容量,树脂吸附量与吸附率均是评价树脂性能的重要指标,吸附量及吸附率公式表示如下:
其中,Q为吸附达到平衡时的树脂吸附量(mg/g);E为吸附达到平衡时的树脂吸附率(%);C0为吸附前溶液的浓度(g/L);C为吸附平衡后溶液的浓度(g/L);V为溶液体积(L);W为树脂的质量(g)。
2)L-丝氨酸含量的测定:首先对含有氨基酸的洗脱溶液进行预处理,然后采用异硫氰酸苯酯衍生化处理,最后用HPLC-ESI-MS测定氨基酸含量[14]。
1.3.3 离子交换树脂静态交换吸附方法
1)吸附时间对吸附效果的影响:量取2 mL湿树脂于50 mL三角瓶中,加入50 mL已经处理好的酶促转化溶液,放入30℃,100 r/min摇床中振荡一定的时间,每10 min取样一次,每次取样10μL,连续取样2 h,取样之后对样品进行衍生化处理,待样品处理好后进行HPLC分析。
2)上样溶液pH对吸附效果的影响:准确量取8份25 mL浓度为10 mmol/L处理好的酶促转化溶液于250 mL三角瓶中,调节样品溶液的pH,分别使其pH为4、5、6、7、8、9、10、11,每份溶液加入1 mL树脂,放入30℃,100 r/min摇床中连续振荡一定的时间,保持树脂吸附20 min,取样量为10μL,每组取3个平行样。
3)树脂实际交换量的确定:取10 mol/L已经处理好的酶促转化溶液140 mL,调节溶液pH至9,加入到250 mL三角瓶中,置于30℃,100 r/min的摇床中连续振荡吸附一定时间,每组取3个平行样。
1.3.4 离子交换树脂动态交换吸附方法
1)洗脱剂类型对洗脱效果的影响:装好层析小柱和树脂,加入pH为9的酶促转化混合溶液,采用0.2 mol/L茚三酮检测流出液,直到流出液遇茚三酮变紫色时停止上样,保持吸附20 min,去离子水淋洗树脂至流出液pH至7左右,分别采用0.2 mol/L PBS(pH=5)和0.8 mol/L HCl溶液作为洗脱剂,每1 mL收集一次流出液,连续收集30 mL,取10μL做衍生化处理,待样品处理好后进行HPLC分析。
2)洗脱流速对洗脱效果的影响:将适量的湿树脂装入层析柱,缓慢滴加pH为9的酶促转化混合溶液20 mL,用茚三酮检测流出液,直到流出液遇茚三酮变紫色时停止上样,保持吸附20 min,去离子水淋洗树脂至流出液pH至7左右,以0.2 mol/L PBS(pH=5)作为洗脱液,分别考察0.3、0.4、0.5 mL/min流速对洗脱效果的影响。
2 结果与分析
2.1 离子交换树脂的选择
由图1可知,DAION PA312阴离子交换树脂在4.5 h时吸附达到饱和且吸附量相对较大,而AB-8、D301R、201×7树脂在4.5 h时还未到达饱和,吸附平衡时间较长,通过对比发现DAION PA312阴离子交换树脂到达平衡时间相对较快,更利于工业化快速操作,所以选择DAION PA312阴离子交换树脂为提取纯化L-丝氨酸的最佳树脂。
图1 不同树脂对L-丝氨酸的静态吸附曲线
2.2 吸附时间对吸附效果的影响
由表2可知,随着吸附时间的延长,树脂吸附L-丝氨酸的量逐渐增大,10~20 min时树脂吸附氨基酸的量快速增加,20 min时吸附达到饱和,吸附的L-丝氨酸量为25.07 mg/g;吸附率和吸附L-丝氨酸的量呈现相同的趋势,随着吸附时间的增加,树脂的吸附量变化不大,因此,选择20 min为样品上柱后的最佳吸附时间。
图2 吸附时间对吸附效果的影响
2.3 上样溶液pH对吸附效果的影响
由图3可知,样品溶液的pH为4~9时,树脂吸附氨基酸的量整体上呈增加的趋势,吸附率保持持续增加趋势,pH为9时,树脂吸附L-丝氨酸的量及吸附率均达到最大值,当pH为9~11时,相应的吸附量和吸附率逐渐下降,因此样品溶液最适合pH为9。
图3 上样溶液pH对吸附效果的影响
2.4 树脂实际交换容量的确定
由图4可知,树脂连续吸附20 min时,吸附L-丝氨酸的量及相应的吸附率一直保持增加的趋势,20 min后,树脂吸附L-丝氨酸增加趋势放缓,基本达到饱和,吸附率基本不再增加,树脂吸附L-丝氨酸的量约为94.25 mg/g,因此,DAION PA312阴离子交换树脂的实际交换容量为94.25 mg/g。
图4 树脂的实际交换容量
2.5 洗脱剂类型对洗脱效果的影响
由图5可知,采用0.2 mol/L PBS(pH=5)作为洗脱剂可以将丝氨酸和甘氨酸有效地分离并快速地洗脱下来,整个洗脱过程大约需要35 min,而采用0.8 mol/L HCl作为洗脱溶剂时,分离不够彻底,洗脱时间相对较长,洗脱曲线有拖尾现象。
图5 洗脱剂类型对洗脱效果的影响
2.6 洗脱流速对洗脱效果的影响
由图6可知,洗脱峰主要集中在2~18 min,随着洗脱速度的逐渐增大,洗脱曲线逐渐收敛,洗脱效果明显变好。洗脱速度为0.5 mL/min时,洗脱曲线有明显的拖尾现象,此条件下L-丝氨酸的收率较低;洗脱流速为0.4 mL/min时,洗脱过程进行相对较快,无拖尾现象;洗脱流速为0.3 mL/min时,洗脱剂流速较慢容易导致结柱现象,洗脱周期较长。综合考虑以上因素,选择0.4 mL/min为最佳的离子交换洗脱流速。
图6 洗脱流速对洗脱效果的影响
4 小结
本研究采用离子交换法对酶促转化合成的产物L-丝氨酸进行提取纯化,通过对比4种不同离子交换树脂的静态吸附容量,确定选择强碱性阴离子交换树脂DAION PA312作为提取纯化L-丝氨酸最佳树脂,该树脂具有分离范围广,可以与各种无机盐及无机酸发生离子交换,树脂活化、再生方法简单等优点。通过对分离纯化各个阶段的L-丝氨酸含量进行定量分析,确定了最佳的吸附和脱附工艺条件,即吸附条件:上样溶液pH=9,吸附时间为20 min,实际交换容量为94.25 mg/g;脱附条件:洗脱液为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=5),洗脱流速为0.4 mL/min。