稻虱缨小蜂耐热品系的生物和生态学特征

王冰洋，黄庭发，马 莹，汤冰洁，周 强*，张古忍

（1.中山大学生命科学学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州 510275；2.中山大学农学院，广州 510006）

稻虱缨小蜂 Anagrus nilaparvatae Pang et Wang (Hymenoptera：Mymaridae)，广泛分布于浙江、福建、湖南、广东和海南等主要水稻产区[1-3]。稻虱缨小蜂是稻田中的优势寄生蜂种群，常年生活在稻田及田埂植被中，对稻飞虱卵的寄生率为10%～70%，最高达到80%以上[4-6]。稻虱缨小蜂已经被证明是调节稻飞虱田间种群数量的关键生物因子，具有广阔的生物防治应用前景[7,8]。

温度是影响昆虫生长发育和繁殖的重要因素，极端温度可导致寄生蜂产卵量显著下降，甚至不育[9,10]。温度影响稻虱缨小蜂的种群数量和动态，高温是其种群发生的关键限制因子。高温降低稻虱缨小蜂存活率，27 ℃下稻虱缨小蜂存活率可达100%，33 ℃下降到80%左右[11]。高温对稻虱缨小蜂生长发育也有明显的持续性抑制作用，34 ℃下幼期发育历期随世代增加而延长，成虫寿命随世代增加而缩短，羽化率随世代增加而降低[12]。田间调查发现，高温季节下稻虱缨小蜂幼虫存活率明显下降，部分地区成蜂的寄生率下降到10%以下[13,14]。自20世纪90年代以来，全球气温明显升高，稻虱缨小蜂田间种群将面临更加极端的高温天气。因此，深入研究稻虱缨小蜂的耐热能力，能否解决高温对稻虱缨小蜂生长发育和繁殖的限制问题，是正确评价和利用该蜂的生防潜力的基础和关键，也是提高其生物防治效能的重要途径。

针对高温影响稻虱缨小蜂生防效率这一关键问题，我们在实验室内用35 ℃持续高温驯化稻虱缨小蜂，经过24代筛选后得到了稳定的稻虱缨小蜂耐热品系（简称，NR品系）。尽管高温驯化得到的NR品系能在35 ℃人工气候箱中正常生活，但尚不清楚其基本生物学和生态学特征是否因高温驯化而发生改变。为此，在室内特定条件下测定NR品系稻虱缨小蜂生长发育、繁殖和极端温度响应等参数，系统评估NR品系缨小蜂的生防潜力，以期培育和利用可以克服高温环境的寄生蜂种质资源，为稻虱缨小蜂的规模化生产和保护应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

褐飞虱Nilaparvata lugens虫源于2016年在广东省华南农业大学苗圃农场采集，用水稻水培苗长期室内饲养，饲养条件参照尤珂珂等[15]。

稻虱缨小蜂于2018年由浙江大学昆虫科学研究所提供，饲养在（25±1）℃、RH（70±5）%和光周期 14L:10D的人工气候箱（GXZ-380D型，浙江宁波江南仪器厂）中，养蜂笼（长40 cm×宽40 cm×高45 cm，100目尼龙网），以水稻幼苗和褐飞虱混合虫态进行室内饲养传代，该品系标记为HZ品系。取部分HZ品系稻虱缨小蜂置于35 ℃人工气候箱（光周期、湿度和其它饲养条件同HZ品系）驯化24代，该高温驯化的稻虱缨小蜂品系标记为NR品系。

1.2 稻虱缨小蜂不同条件下的发育历期和繁殖力的测定

1.2.1 成蜂收集和发育繁殖参数记录 收集带卵苗：透明亚克力板养虫盆（长25 cm×宽25 cm×高15 cm）中放置15日龄水稻苗130～150根，褐飞虱成虫250～300头，2 d后移除成虫；收集寄生卵和成蜂：取带卵苗50根，置于养蜂笼内，引入足量稻虱缨小蜂，1～2 d后收集褐飞虱卵（可能被寄生卵），或者饲养一段时间后收取成蜂。发育历期和繁殖参数：取带卵苗5根，置于试管（Φ3 cm×17 cm）中，引入1头羽化8 h内已交配的稻虱缨小蜂雌虫，100目尼龙网布封口，6 h后移除小蜂，并将此时记录为发育起点时间。定时用体式显微镜（Olympus SZX7）观察和记录寄主卵变化，寄主卵变红或黄后，即可确认为寄生卵，寄生卵变色前的阶段为卵-幼虫中期；在体式显微镜下将寄生卵移至垫有湿润滤纸的培养皿（Φ9 cm×1.3 cm），至寄生蜂出现淡红褐色的复眼和单眼前的阶段为幼虫后期；至寄生蜂的触角、前翅、足和生殖器等均发育完全前的阶段为蛹期；至寄生蜂破壳前的阶段为隐成蜂期。出蜂后，记录未羽化卵数、雌雄个数和成蜂死亡时间，统计产卵量、性比和成虫寿命。

1.2.2 温度梯度设置和处理 利用人工气候箱设置15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃共5个温度处理，其他条件与1.1相同。用1.2.1的方法饲养和记录小蜂发育历期和产卵量等参数。每一温度处理15头，3个重复。

1.3 稻虱缨小蜂高温击倒温度、击倒时间和存活曲线

击倒温度：透明玻璃指形管（Φ1.2 cm×7 cm）中分别引入1头羽化8 h内的稻虱缨小蜂，棉花塞封口，将其置于人工气候箱内（其他条件均与1.1相同）。从30 ℃开始以0.01 ℃/s的速率升温，蜂瞬时倒下那一刻的温度记为击倒温度，每个处理10头，3个重复。

击倒时间：将稻虱缨小蜂从 25 ℃人工气候箱转移到 50 ℃箱中，计时，蜂倒下一刻计时，此时间差为击倒时间，每个处理10头，3个重复。

存活曲线：用上述指形管将缨小蜂分别置于（42±1）℃和（25±1）℃的人工气候箱（其他条件均与1.1相同）内，每3 h补充水分并记录存活蜂的数量，每个处理20头，3个重复。

1.4 补充营养

配置浓度为10%的蔗糖、葡萄糖和蜂蜜共3种营养补充剂，纯水为对照。用1.2.1方法饲养小蜂，并用微型移液器在试管管壁内点涂少量营养补充剂，置于人工气候箱中（条件与1.1相同），每6 h记录蜂的数量，统计存活率。出蜂后，记录未羽化卵数、雌雄个数，统计产卵量，每个处理15头，3个重复。

1.5 不同日龄寄主卵

用1.2.1方法收集带卵苗，移除褐飞虱成虫的时间改为1 d，分别在1、3和5 d后引入1头羽化8 h内已交配的稻虱缨小蜂雌蜂，出蜂后，记录未羽化卵数、雌雄个数，统计产卵量，每个处理15头，3个重复。

1.6 数据统计与分析

将不同温度下各虫态的发育历期（N）换算成发育速率（V＝1/N），利用最小二乘法计算出各虫态的发育起点温度和有效积温[16]，计算公式如下：K＝(nΣVT―ΣVΣT)/[nΣV2―(ΣV)2]；C＝(ΣV2ΣT―ΣV ΣVT)/ [nΣV2―(ΣV)2]；T＝C＋KV。式中，K为有效积温，C为发育起点温度，T为环境温度，n为温度处理组数。

试验数据处理均采用Graphpad Prism 8.0.2软件进行统计分析并作图，两处理间平均值差异用t检验，多组处理间的数据采用单因素方差分析（ANOVA），Tukey法比较差异显著性。不同处理生存曲线之间的比较用Log-rank（Mantel-Cox）检验。*表示数据间在0.05 水平差异显著。

2 结果与分析

2.1 稻虱缨小蜂耐热品系的发育历期

稻虱缨小蜂NR品系发育历期均随温度上升而缩短，波动规律与未经高温驯化的HZ品系类似（图1）。但20 ℃下平均发育历期为（15.61±0.15）d，显著小于HZ品系的（19.65±0.18）d（t＝16.98，df＝44，P＝0.0037），15 ℃下HZ品系发育迟缓，60 d内未观察到有效的试验数据。25 ℃～35 ℃的条件下，与HZ品系相比，NR品系的发育历期无明显变化。

本文中，我们提出去中心化、不可篡改和激励机制属于区块链技术的本质特点，而可追踪、匿名、可编程属于区块链数据之上的功能特性，以此可以区分一些区块链项目和借区块链概念的项目。进一步地，我们分析了区块链技术在IoT场景的几个应用，对其中的主要问题和主要方法进行了阐述，指出IoT的数据体量和数据安全问题依旧是区块链技术在IoT场景应用需要重点考虑的问题。

与HZ品系相比较，在高温范围（30 ℃～35 ℃）内，NR品系各虫态的发育时长无显著差异（图2 A，B）。中低温范围（15 ℃～25 ℃）内，NR品系的发育时长有小于HZ品系的趋势，其中15 ℃时，HZ品系不能顺利出蜂，NR品系虽耗时较久，但仍可以出蜂（图2 C～E）；20 ℃时，NR品系的发育时长显著小于HZ品系，这一差异主要表现在卵-幼虫中期和蛹期的发育时间明显缩短，分别快了1.78 d（t＝10.89，df＝44，P＜0.0001）和 2.30 d（t＝10.54,df＝44，P＜0.0001）（图 2D）。

2.2 稻虱缨小蜂耐热品系各虫态的发育起点和有效积温

NR品系卵-幼中期和蛹期的发育起点温度均低于HZ品系，有效积温高于HZ品系，隐成蜂期的结果与此相反，但差异均不显著。NR品系幼虫后期的发育起点温度和有效积温显著低于HZ品系（表1）。

2.3 温度对稻虱缨小蜂寄生力的影响

极端温度除了影响寄生蜂的生长发育外，对生殖也有不利影响。15 ℃～30 ℃范围内，稻虱缨小蜂NR品系的单雌产卵量为（21.23±1.16）粒，与HZ品系间的（19.38±0.99）粒相比无显著差异（t＝1.208，df＝78，P＝0.2305）。在35 ℃高温条件下，NR品系产卵量仍能达到（18.80±1.13）粒/雌，显著高于HZ品系的（9.50±0.92）粒/雌（t＝6.366，df＝18，P＜0.0001）（图 3）。

图3 不同温度下稻虱缨小蜂耐热（NR）和对照（HZ）品系的产卵量Fig.3 Fecundity of A.nilaparvatae thermotolerant (NR) strain and control check (HZ) strain at different temperatures

2.4 稻虱缨小蜂对极端高温的响应

NR品系雌、雄蜂在极端高温（50 ℃）环境下的击倒时间无明显差异，分别为（13.35±0.50）min和（15.19±0.47）min，不同品系的雌蜂间也无明显差异，但NR品系雄蜂的击倒时间显著长于HZ品系雄蜂的（12.16±0.40）min（t＝4.725，df＝21，P＝0.0003）（图4A）。击倒NR品系雌、雄蜂所需要的温度均比 HZ品系低。NR品系雌、雄蜂的击倒温度分别为（48.44±0.12）℃和（48.71±0.13）℃，显著低于HZ 品系的（49.13±0.14）℃（t＝3.634，df＝18，P＝0.0036）和（49.41±0.16）℃（t＝3.463，df＝18，P＝0.0053）（图4 B）。

图4 稻虱缨小蜂耐热（NR）和对照（HZ）品系对极端高温的响应Fig.4 Response of A.nilaparvatae thermotolerant (NR) strain and control check (HZ) strain to extreme high temperature

为研究极端高温对稻虱缨小蜂成虫寿命的影响，以按时补充水分为前提，比较不同温度条件下NR品系和HZ品系的寿命和存活曲线。25 ℃下，品系间寿命无显著差异，42 ℃下，NR品系成虫的平均寿命为（18.11±1.03）h，HZ品系的平均寿命为（10.21±0.31）h，两者间差异显著（t＝7.454，df＝110，P＜0.0001）（图5A）。两个品系的存活曲线在25 ℃环境中无明显差异（χ2＝0.8411，P＝0.3591），个体死亡主要集中在成虫期的中间阶段。42 ℃下，品系间存活曲线差异显著（χ2＝45.67，P＜0.0001），成虫前期个体死亡较多（图5B）。

2.5 补充营养对稻虱缨小蜂耐热品系的影响

补充营养对稻虱缨小蜂NR品系雌蜂寿命和产卵量均有影响。25 ℃下，NR品系雌蜂补充10%蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液和10%蜂蜜溶液后的平均寿命分别为（105.6±8.63）h，（100.32±9.50）h，（81.6±9.97）h，均极显著高于纯水对照组的（18.72±2.27）h（F＝23.68，P＜0.0001）（图6 A，B）。35 ℃下补充10%蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液和10%蜂蜜溶液后的平均寿命分别为（57.60±5.25）h，（54.00±4.41）h，（43.20±5.22）h，均显著或极显著高于纯水对照组的（19.56±1.80）h（F＝15.18，P<0.0001）（图6 C，D）。

图6 补充不同营养对稻虱缨小蜂耐热（NR）品系存活率的影响Fig.6 Effect of complement different nutriments on survival of A.nilaparvatae thermotolerant (NR) strain

补充不同营养能刺激NR品系的产卵量。25 ℃下，NR品系稻虱缨小蜂取食10%蔗糖溶液、葡萄糖溶液、蜂蜜溶液后的产卵量分别为（26.8±6.48）粒/雌、（27.2±6.29）粒/雌和（26.6±5.73）粒/雌，显著高于纯水对照组的（18.72±1.69）粒/雌（F＝5.777，P＝0.0025）（图7A）。但在35 ℃条件下，只有补充10%蔗糖溶液显著提高了寄生蜂的产卵量（t＝4.758，df＝18，P＝0.0019）（图7B）。

图7 补充不同营养对稻虱缨小蜂耐热（NR）品系产卵量的影响Fig.7 Effect of complement different nutriments on fecundity of A.nilaparvatae thermotolerant (NR) strain

2.6 寄主卵龄对稻虱缨小蜂产卵量的影响

稻虱缨小蜂NR品系与HZ品系对不同龄期褐飞虱卵的产卵量无显著差异，NR品系对1 d龄褐飞虱卵的产卵量可达（24.3±5.31）粒/雌，高于HZ品系的产卵量（20.1±3.45）粒/雌，但差异不显著（t＝1.990，df＝18，P＝0.062）（图 8）。

3 讨论

寄生蜂的发育历期与其生存环境温度有关，在15 ℃和20 ℃条件下，NR品系较HZ品系的发育速率更快。15 ℃下，NR品系蜂卵发育至出蜂历时40 d左右，HZ品系经40 d的生长发育，大部分蜂卵的虫态停留在幼虫中期，少部分进入幼虫后期，发育至羽化出蜂需要的时间更久。20 ℃下NR品系稻虱缨小蜂发育速率快，发育历期明显短于HZ品系。另一种卵寄生蜂松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi也有类似的研究报道，湖北地区的松毛虫赤眼蜂需要21.6 d，而高纬度地区黑龙江松毛虫赤眼蜂仅为19.1 d[17]。NR品系隐成蜂期之前各个虫态的发育起点温度均比HZ品系低，有效积温比HZ品系高，说明NR品系在较低温度下可以开始并完成发育，而HZ品系需要的温度较高。目前稻虱缨小蜂高温驯化方面的研究报道较少，耐热性相关的生理和生化机制有待进一步的研究。

稻虱缨小蜂的最适产卵温度为22.79 ℃，平均产卵量约为20粒，温度达到30 ℃以上时缨小蜂产卵受到抑制，产卵个体减少，单雌平均产卵量减少69%，并且产卵历期明显缩短，夏季野外30 ℃以上条件不适合释放缨小蜂来防治田间飞虱类害虫[18]。经过高温驯化的稻虱缨小蜂品系在正常温度下平均单雌产卵量超过21粒，35 ℃下的产卵量仍能维持正常，即相对于没有进行高温驯化的稻虱缨小蜂品系，NR品系对极端高温的适合度大，高温下的寄生能力稳定，更耐高温。另外，研究过程中发现，NR种群密度基本稳定，表明经过多代驯化后，该种群已经基本克服高温导致的羽化率累积下降现象。昆虫对极端温度的耐受性是其种群持续和快速增长的重要基础，保持正常的产卵量是寄生蜂生物防治效率的前提，随着全球变暖进程的加速，环境温度逐年上升，对于依靠环境温度调节生理功能的昆虫来说，许多昆虫因没有足够的生理耐受力而无法在其栖息地最高温度下生存。NR品系稻虱缨小蜂既能在正常温度下生存，也能在高温下维持种群稳定，用其作为生物防治手段具有广阔的潜力。

击倒温度和击倒时间是评价昆虫耐热性的两种常用方法，热击倒温度是指加热过程中昆虫倒下那一瞬间所对应的温度，温度越高表明昆虫的热耐受能力越强[19]。NR品系稻虱缨小蜂的热击倒温度比 HZ品系低 0.70 ℃。热击倒时间是指昆虫暴露在恒定高温下到被击倒所需的时间，时间越长表明昆虫的快速热耐受能力越强[20]。50 ℃下，NR品系雄蜂的击倒时间显著长于HZ品系雄蜂，极端高温条件下坚持时间延长了约20%。NR品系对极端温度的高耐受性有利于该品系在高温环境中的定殖，是寄生蜂发挥有效并持久的生物防治作用的基础。但只用击倒时间和击倒温度来评价该昆虫的耐热性并不全面，还要考虑耐热可塑性和半致死温度等其他指标[21]。

自然生态系统中，寄生蜂较容易获得的食物主要有植物花粉、花蜜[22]和部分同翅目昆虫的蜜露[23]。补充营养可延长寄生蜂成虫寿命、促进生殖系统发育成熟以及提高产卵量。正常温度条件下，NR品系补充不同营养物质均能明显延长寿命和提高产卵量。35 ℃时，只有10%蔗糖溶液既能明显延长其存活时间，又显著提高产卵量。这表明多种物质都可以用作常温饲养NR品系的营养补充，蔗糖则可以作为高温饲养或者田间释放的营养补充。

NR品系对极端温度的耐受力强，在高温下仍能保持较高水平的繁殖力，这既有利于夏季高温天气下稻飞虱的防治，也为建立高效稳定的稻虱缨小蜂田间种群提供了可能。寄生蜂生产成本的评估是规模化繁育的考量指标之一，NR品系稻虱缨小蜂需要在35 ℃下培养来保持其耐极端温度的能力，维系此品系的成本较高，需要寻找不影响其耐受性且能够降低成本的办法。例如波动温度条件下饲养的寄生蜂比恒温饲养的寄生蜂生长发育时间缩短，成年雌性寿命延长，繁殖力提高，对极端温度的适应性增强，成本降低[24,25]。因此下一步的研究工作中，用波动高温培育稻虱缨小蜂是非常值得尝试的方案。

昆虫栖境并非恒定不变，在自然条件下，除了温度，稻虱缨小蜂还受湿度、光周期等非生物因子，以及寄主、水稻和杂草植物等生物因子的影响，因此未来还需针对各种生态因子对稻虱缨小蜂的影响作系统研究，为后续大规模培育和利用耐高温的缨小蜂品系提供帮助。