一株鸡源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离鉴定及耐药性分析

钟敏，邱光忠，胡艳，林小翠，郭小波，成笛，钟如意，刘瑞平

（赣州市畜牧水产研究所，江西赣州341000）

禽多杀性巴氏杆菌病又名禽霍乱，是由多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症，各个日龄的鸡都可感染，其中以成年鸡的易感性最高，但幼龄鸡感染后病死率高，临床症状通常以急性禽霍乱为主,病鸡精神抑郁、羽毛蓬松、发烧、厌食、剧烈腹泻，发生败血症，最后发生衰竭，猝死，极大地危害家禽养殖行业的发展，慢性病例主要发生肺炎、关节炎，且肉髯、鸡冠出现水肿等[1]。

1880年Pasteur首次研制出禽霍乱的弱毒疫苗以来，世界各国学者相继进行了大量的科学研究工作，在禽霍乱的免疫防制中发挥了重要作用，虽然这些疫苗对防治禽霍乱的发生起到积极作用，但仍有免疫失败的问题，主要是因为多杀性巴氏杆菌血清型繁多、疫苗免疫谱窄和保护期较短等多种原因。药物防治仍是目前临床上采用比较多的方法，但由于抗生素滥用，多杀性巴氏杆菌产生了耐药性，未经药敏试验的盲目用药导致药物治疗效果不理想，致使本病仍未得到有效的控制。本试验采用16SrRNA方法对疑似禽霍乱死亡鸡进行了细菌鉴定，并对其血清型、耐药性进行检测，为临床该病的防治提供参考。

1 材料

1.1 病料

75日龄死亡宁都黄鸡，剖检可见皮下组织、腹膜以及腹部脂肪存在不同大小出血点，心外膜以及心冠脂肪出血，肝脏肿大呈棕红色，表面散布针尖大的黄白色坏死点，脾脏肿大如球状，肠道出血严重，肠内容物血样，黏膜充血出血，疑似多杀性巴氏杆菌感染。

1.2 主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、微量生化发酵管购自海博生物技术有限公司；2×pro Taq PCR Master-Mix、DL2000 DNA Marker等购自北京全式金生物技术有限公司；革兰氏染色液、药敏纸片购自杭州滨河微生物试剂有限公司。

1.3 标准菌株

大肠埃希氏菌ATCC25922由福建省农科院畜牧兽医研究所提供。

2 方法

2.1 细菌分离培养

无菌采集病死鸡肝脏和脾脏，划线接种于TSA培养基，37℃恒温培养24h，待平板上长出肉眼可见的菌落后，对分离菌进行纯化培养。根据菌落的形态挑取疑似多杀性巴氏杆菌的单菌落进行革兰氏染色镜检，染色方法参照兽医微生物学方法进行[2]。

2.2 细菌生化鉴定

将纯化后的细菌按常规方法接种于生化反应管和微量发酵管等，按常规生化试验进行，具体操作步骤按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版方法进行，按说明进行判定[3]。

2.3 分离株16SrRNA鉴定

采用热裂解法提取细菌DNA为模板，以16Sr-RNA通用引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT)对目的基因进行PCR扩增。PCR反应体系25μL：2×pro Taq PCR MasterMix 12.5μL,上下游引物各1μL，DNA模板2μL，补充ddH2O至25μL。PCR反应条件：94℃预 变 性5 min,94℃变 性30s，55℃退 火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。将PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物，送至上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果递交NCBI网站进行BLAST比对。

2.4 分离株血清型鉴定

合成用于检测多杀性巴氏杆菌种属特异性的Kmt基因引物(F:ATCCGCTATTTACCCAGTGG;R:GCTGTAAACGAACTCGCCAC)和A型荚膜的引物（F:TGCCAAAATCGCAGTCAG；R:TTGCCATCATTGT CAGTG），采用热裂解法制备细菌DNA模板，对目的基因进行PCR扩增，PCR反应体系25μL:2×pro Taq PCR MasterMix12.5μL,Kmt基因上下游引物、荚膜上、下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，补充ddH2O至25μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min,共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 分离株耐药性分析

采用Kirby-Baner（KB）纸片扩散法对分离菌株进行药敏试验。以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株，量取抑菌圈直径，并根据CLSI标准对试验结果进行判定[4]。

3 结果

3.1 细菌分离培养及生化鉴定

无菌采集病死鸡肝脏和脾脏组织接种于TSA培养基，37℃恒温培养箱培养24h后，可见大小、形态一致的灰白色圆形菌落，边缘整齐，半透明样，经革兰氏染色形态为革兰氏阴性短小杆菌，两端钝圆，单个或成双排列（图1）。将纯化后的细菌进行生化鉴定，结果显示分离株能分解葡萄糖和蔗糖，产酸不产气，可形成靛基质，产生硫化氢，甲基红和VP试验均为阴性，符合多杀性巴氏杆菌生化特征。

图1 分离株革兰氏染色镜检结果

3.2 分离株16SrRNA鉴定

采用细菌16SrRNA通用引物对分离株进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小约为1 500bp（图2），将PCR产物送至上海生物工程股份有限公司测序，将测序结果与NCBI数据库中参考菌株16SrRNA进行BLAST同源性对比。果显示，分离株与多杀性巴氏杆菌参考株同源性大于99%。结合细菌形态观察、生化特性和16SrRNA基因序列分析，可判定分离株为多杀性巴氏杆菌。

图2 分离株16SrRNA PCR扩增产物电泳图

3.3 分离株血清型鉴定

以分离株的核酸为模板，采用多杀性巴氏杆菌种属特异性Kmt基因引物和A型荚膜引物对目的基因进行PCR扩增，PCR产物电泳结果见图3，如图所示扩增出片段大小为460bp和1 000bp左右的目的条带，表明分离株为荚膜血清A型的多杀性巴氏杆菌。

图3 分离株Kmt基因和A型荚膜基因双重PCR扩增产物电泳图

3.4 分离株耐药性分析

采用纸片扩散法对分离株进行药物敏感性测定，结果显示分离株对氨苄青霉素、头孢噻肟、恩诺沙星、多粘菌素敏感，对青霉素G、链霉素、四环素、氟苯尼考高度耐受。

表1 分离菌株耐药性检测结果

4 讨论

多杀性巴氏杆菌是一种革兰氏阴性短小杆菌，有荚膜，无鞭毛，不形成芽孢、不运动，可感染多种动物以及人，引起禽霍乱、猪肺疫等多种传染病。1955年Carter运用间接血凝试验依据荚膜抗原的差别，将多杀性巴氏杆菌分成A、B、D、E、F5种血清型[5]，引起禽多杀性巴氏杆菌血清型大多数是血清A型[6],如陶娅从江苏暴发禽霍乱病例中分离出的12株多杀性巴氏杆菌[7]，荚膜血清型鉴定结果显示皆为荚膜A型；唐沙从贵州发病鸡分离的多杀性巴氏杆菌[8]，采用5对分型引物进行基因分型检测，结果仅有A型引物扩增到大小1 050bp的目的基因片段,表明分离菌为A型多杀性巴氏杆菌；李伟杰从湖南某鸡场分离的多杀性巴氏杆菌[9]，经PCR鉴定为A型。本试验从江西赣南地区宁都黄鸡养殖场分离的多杀性巴氏杆菌也为荚膜A型，表明目前流行我国的鸡源的多杀性巴氏杆菌，其荚膜血清型没有发生变化，仍以A型为主。

仇桂玲从广东分离的多杀性巴氏杆菌对丁胺卡那霉素、氟苯尼考和多粘菌素B均敏感[10]，但对卡那霉素、链霉素和强力霉素等表现出不同程度的耐药性；丁成接从广西产蛋鸡分离的多杀性巴氏杆菌[11]，药敏药敏试验结果表明,分离菌对环丙沙星、恩诺沙星、四环素、痢特灵、氧氟沙星敏感，对链霉素、新霉素、强力霉素、阿莫西林等药物表现出不同程度的耐药性。从中可以看出，不同地区流行的鸡源多杀性巴氏杆菌，耐药性也会呈现不同结果，可能与实际生产中使用抗生素情况不一致有关。而同一地区，不同时间、不同养殖场流行的鸡源多杀性巴氏杆菌对药物的敏感性也不相同，比如，同样是从江西分离的鸡源多杀性巴氏杆菌，黄萃2019年从江西南昌乌鸡源分离的多杀性巴氏杆菌对氨苄西林、丁胺卡那、多西环素和恩诺沙星敏感[12]，对头孢曲松、卡那霉素、氟苯尼考、红霉素、林可霉素和诺氟沙星耐药；殷贵虎从江西南昌某规模化养鸡场分离的多杀性巴氏杆菌对恩诺沙星、青霉素、头孢噻肟、阿莫西林、氧氟沙星和头孢曲松高度敏感[13]，对氨苄西林、复方新诺明、氟苯尼考、土霉素、丁胺卡那耐药。本试验与以上学者分离的鸡源多杀性巴氏杆菌对药物的耐药性也存在一定差异，分离株对氨苄青霉素、头孢噻肟、恩诺沙星、多粘菌素敏感，对青霉素、链霉素、四环素、氟苯尼考高度耐受，表明本试验结果对其他地区多杀性巴氏杆菌病防治不太适用，具体防治措施还得根据当地流行情况和耐药性检测结果制定。本试验结果提示，近期在江西赣州市宁都黄鸡养殖场治疗禽霍乱时，优先选用氨苄青霉素、头孢噻肟、恩诺沙星、多粘菌素等药物，同时应注意交叉和轮换用药，避免耐药菌株产生。

多杀性巴氏杆菌为条件致病菌，正常情况下，寄生在宿主的上呼吸道黏膜以及下泌尿道黏膜上，并不使宿主感染致病。在高温、潮湿、多雨的夏、秋季节，以及气候多变的春季最容易发生，温度忽高忽低造成宿主的免疫力下降时，多杀性巴氏杆菌就很容易侵入机体，在局部大量繁殖，突破局部的防御体系进入血液引起菌血症和败血症的表现，造成疫病快速流行，发病率可高达100%，严重影响动物生长和畜产品安全，给养殖户造成重大经济损失。因此在平时的生产中，还需加强免疫预防和饲养管理，适时给鸡群接种禽霍乱弱毒活菌苗或者氢氧化铝疫苗，使机体形成免疫力，预防发病。鸡场最好坚持自繁自养，尽可能减少到外地引进鸡，并采取全进全出的饲养方式,制定合理的饲养管理制度和卫生防疫制度，保持舍内通风换气良好，定期进行消毒，在气候突变时加强防寒保暖，避免发生应激，减少发病。