TLR4 mRNA和TCF21 mRNA在喉癌组织中的表达及其与临床病理的相关性

杨湘，马鹏，冯俊

(南充市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，四川 南充 637000)

喉癌是临床较常见的咽喉恶性肿瘤，发生率占全身恶性肿瘤的5%～7%，且有侵袭能力强、易复发、易转移、预后差等特点，严重威胁着患者身心健康[1]。早期喉癌采用手术、放化疗、基因疗法等综合手段进行治疗，可获得较好的疗效，但大多数患者在确诊时病情已进展到中晚期，疗效欠佳。因此，了解喉癌的生长、转移机制，及早确诊对于患者治疗及预后改善具有重要的意义。近年来，随着喉癌发生率逐渐升高，恶性肿瘤发生发展的分子机制引起学者的重视。TOLL样受体(TLRs)是核因子κB(NF-κB)的潜在激活剂，已有大量研究证实其是炎症病变与恶性肿瘤发生间的桥梁[2]，在胰腺癌、肺癌中呈高表达[3]。转录因子21(TCF21)属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白家族成员之一，对促进细胞生长、分化具有一定的调控作用，当前已被证实其在肺癌、乳腺癌、肾癌等多种癌症中可作为抑癌基因参与肿瘤发生发展[4]。然而，关于TLR4、TCF21在喉癌中的具体表达情况及其临床意义、相关机制等仍未明确。本研究旨在探究TLR4 mRNA、TCF21 mRNA在喉癌组织中的表达情况，初步分析潜在机制，为喉癌的临床诊断及治疗提供新依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2018年11月至2020年6月南充市中心医院收治的95例喉癌患者为研究对象，术前均完善颈部增强CT、电子纤维喉镜、病理活检确诊为喉鳞状细胞癌，且在手术前未接受过放化疗。其中男性86例，女性9例；年龄45～76岁，平均(58.09±7.55)岁；癌症位置：声门型59例，声门上型30例，声门下型6例；组织学分化：低分化40例，中分化29例，高分化26例；淋巴结转移情况：N037例，N136例，N222例；浸润深度：T1～269例，T3～426例；临床分期：Ⅰ期41例，Ⅱ期34例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。在手术过程中，留取喉癌组织以及距离喉癌3～6 cm的癌旁正常组织作为实验样本，样本取出后迅速将其存放到装有RNALATER溶液的冻存管中中，在-80 ℃中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂 PCR扩增仪(美国应用生物系统公司)；微量高速离心机(上海锦玟仪器设备有限公司)；可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。TRIzon总RNA提取试剂(上海联迈生物工程有限公司)；TCF21、TLR4引物序列(上海英骏生物技术有限公司)；cDNA第一链合成试剂盒(上海烜雅生物科技有限公司)；invitrogen反转录试剂盒(北京优尼康生物有限公司)；cDNA逆转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)。

1.2.2 TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表达水平测定 采用RT-PCR技术，具体如下：(1)总RNA提取：提取样本组织中的中RNA，严格按照TRIzon总RNA提取试剂说明书进行操作。取2 μL RNA样本，用SP-723/723 PC可见分光光度计在260 nm下的吸光度测定定量样本组织中定量RNA浓度。检测RNA在260 nm、280 nm下的吸光度分析RNA纯度测定，记录OD260/OD280，所有样本的OD260/OD280比值要求为1.7～2.0，低于此必须提示提取的RNA含有蛋白质杂志，需应用氯仿重新提纯。同时应用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。(2)cDNA合成：以总RNA作为模板，应用invitrogen反转录试剂盒合成cDNA。取0.2 mL经DEPC处理过的PCR管，冰浴条件下在PCR管内配置反转录反应液。(3)RT-qPCR反应：按照cDNA逆转录试剂盒说明书进行TLR4和TCF21引物合成操作。在PCR管内依次加入：1 μL反转录产物，基因上游与下游引物各0.25 μL，PCR反应mix12.5 μL，并加入ddH2O是管内溶液体积达到25 μL。混匀PCR管内溶液，将其置于PCR仪中按照反应条件(95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，共28个循环)完成RT-qPCR反应。反应结束后，将样品存放到-20℃冰箱中备用。内参GAPDH引物(扩增片段116 bp)，上游序列：5′-CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA-3′,下游序列：5′-ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA-3′；TLR4引物(扩增片段356 bp)，上游序列TLR4：5′-GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T-3′，下游序列：5′-ATG GGT TTT AGG CGC AGA GTT T-3′；TCF21引物(扩增片段127bp)，上游序列：5′-TGC GTT CGC TAC ATA CAA GGT G-3′，下游序列：5′-TCT GTG ACT TGG CGT CTC GG-3′。(4)计算TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表达水平：同一样本不同基因在不同PCR管中机械能，扩增后对扩增曲线、溶解曲线进行分析，获得循环阈值(CT值)，最后通过2-△△Ct法计算TLR4 mRNA、TCF21 mRNA在喉癌组织内相对表达水平(△△Ct值=喉癌组织△Ct(目的基因)-癌旁组织△Ct(目的基因，△Ct值=Ct目的基因-Ct内参基因)。

1.3 观察指标

(1)喉癌组织、癌旁组织中TLR4 mRNA、TCF21mRNA表达水平；(2)TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表达水平与喉癌患者组织分化程度、淋巴结转移情况、临床分期、病理特征、浸润深度等临床病理特征的关系。(3)喉癌组织中TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表达水平的相关性。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 喉癌组织与癌旁组织TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表达水平比较

喉癌组织的TLR4 mRNA表达水平高于癌旁正常组织(P<0.05)，而喉癌组织TCF21 mRNA表达水平较癌旁正常组织降低(P<0.05)。见表1。

表1 喉癌组织与癌旁组织TLR4、TCF21mRNA表达水平比较

2.2 喉癌组织不同病理特征TLR4、TCF21mRNA表达水平比较

在喉癌组织中，TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表达水平与癌组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期的差异有统计学意义(P<0.05)，而在病灶位置、肿瘤大小、病理形态的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 喉癌组织不同病理特征TLR4、TCF21mRNA表达水平比较

2.3 喉癌组织中TLR4 mRNA、TCF21m RNA表达水平与各种病理特征的相关性

相关性分析显示，喉癌组织中TLR4 mRNA表达水平与癌组织分化程度呈负相关，与浸润深度、淋巴结转移、临床分期呈正相关(P<0.05)；TCF21 mRNA表达水平与组织分化程度呈正相关，与浸润深度、淋巴结转移、临床分期呈负相关(P<0.05)；癌组织的TLR4 mRNA表达水平与TCF21 mRNA表达呈负相关性(r=-0.454，P<0.001)。见表3。

表3 喉癌组织中TLR4、TCF21mRNA表达水平与各种病理特征的相关性

3 讨论

在临床上，早期喉癌容易被漏诊，但此阶段的病灶经手术、放化疗治疗后往往会达到临床治愈的标准，而中晚期喉癌虽易确诊，但患者即使进行综合手段治疗后仍会有呼吸、吞咽、发音功能障碍等问题，使其生存率、生存质量严重降低[5]。因此，早期诊断早治疗至关重要。当前，关于喉癌病因的相关研究报道较多，但其分子机制尚无明确的研究结果，而且针对喉癌的基因疗法、靶向治疗效果仍有效，故在分子水平上对喉癌的发生、发展机制进行研究为临床热门话题，能够在一定程度上提升喉癌的诊治水平[6]。

文献报道[7]慢性炎症可显著升高癌症的发生风险，Toll样受体(TLR)家族为参与非特异性免疫的模式识别受体，其能够介导机体免疫反应、慢性炎症反应的发生发展而且对肿瘤生物学特性也有一定的影响[8]。TLR4为Ⅰ型跨膜蛋白受体，定位于17号染色体，TLR4在前炎性因子与特异性配体结合后可被激活，使TLR4信号传导至下游通路，促使炎症反应发生，与此同时也能够诱导细胞增殖、分化[9]。大量研究证实TLR4可经过多种方式参与肿瘤发生、发展[10]。相关研究[11]指出，炎性配体可通过TLR4信号通路使体内的NF-κB被激活，进而参与炎症发展为肿瘤这一病理过程。Galle等[12]研究显示，HSP70 1A蛋白为炎症的内生性配体之一，其能够促使癌细胞的TLR4表达水平升高，释放大量HMGB1物质，进而通过TLR4通过激活NF-κB，增强Hep-2喉癌细胞凋亡抵抗性，促使癌细胞增殖分化。本研究结果显示，喉癌组织中的TLR4 mRNA表达水平较癌旁正常组织要高(P<0.05)，且其表达水平与癌组织分化程度呈负相关，与浸润深度、淋巴结转移、临床分期呈正相关(P<0.05)，可能与TLR4与自身配体结合后产生的一系列级联反应有关。TLR4可通过一系列信号转导(如髓样分化因子88依赖途径和非依赖途径)，上调抗原递呈细胞，激活特异性免疫应答，帮助机体抵抗病原微生物的感染和修复损伤的组织，但是当TLR4传导通路持续或异常活化可能会介导炎症通路，引起炎症反应，促使肿瘤免疫逃逸。Shyam等[13]的研究也发现，TLR4信号通路能够刺激TNF-α等促炎物质大量分泌，进而参与到肿瘤新生血管形成，或促使癌细胞黏附、迁移，导致癌细胞侵袭、转移，进一步说明了TLR4 mRNA可能参与喉癌的发生、发展。

本研究还发现喉癌组织的TCF21 mRNA表达较癌旁组织要低(P<0.05)，且其表达水平与癌组织分化程度呈正相关，与浸润深度、淋巴结转移、临床分期呈负相关(P<0.05)。TCF21为近年新发现的抑癌基因中的一种，属于bHLH家族成员之一，被证实可影响细胞增殖、分化等生理过程的转录调控因子[14]。Wei等[15]的研究发现约有80%以上的喉癌患者会出现TCF21甲基化或TCF21表达下调，也正式由于其表达下调致使细胞DNA修复基因的生理功能异常，难以及时修复损伤DNA结构，对细胞生长分化产生一定抑制作用，进而引起抑制细胞异常增殖的能力有所降低，诱发癌症。另有研究[16-17]报道，过表达TCF21能够通过对细胞周期、细胞凋亡相关因子的表达水平产生调控作用，进而阻止人喉癌细胞株Hep-2增殖分化，促进细胞凋亡，故TCF21可成为喉癌诊断或靶向治疗的潜在作用位点。此外，本研究显示癌组织的TLR4 mRNA表达水平与TCF21 mRNA表达呈负相关性(r=-0.454，P<0.001)，提示TCF21能够负性调节喉癌组织TLR4表达，并可抑制细胞的侵袭、转移能力，但其具体机制仍有待进一步深入研究。

综上，TLR4高表达、TCF21低表达在喉癌发生发展过程中发挥着重要的作用，两者具有一定的相关性，相互作用可能促进喉癌细胞恶性增殖分化，故检测TLR4、TCF21表达水平有望成为喉癌患者病理特征判断的主要生物学指标，为本病诊疗提供可靠的依据。