基于CYP1B1酶抑制活性的泽泻95%乙醇提取物化学成分的UPLC-IT-TOF/MS分析*

张 敏，陈兴龙，李 兰，龙俊君，罗永谋，唐丽萍，李 勇△

（1.昆明医科大学附属甘美医院/昆明市第一人民医院，云南 昆明 650224；2.云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用重点实验室,云南 昆明 650500；3.昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室,云南 昆明 650500）

细胞色素 P450 1B1（Cytochrome P450 1B1，CYP1B1）酶是一种催化底物环氧化及羟基化的亚铁血红素-硫醇盐单加氧酶，研究表明，CYP1B1基因突变及进而抑制CYP1B1酶参与的相关底物如视黄酸、褪黑素、花生四烯酸等的代谢与青光眼的发病存在关联[1-2]。

传统中药在治疗青光眼方面有悠久的应用历史，眼科专著《眼科龙木论》，提出了五风内障之说，对青光眼的病因病机、临床证候、治疗方药、针灸等作出详细论述[3]。来自药用植物的天然产物化学结构多样，经过了长期的生物选择，具有较好的生物契合度和类药性，是药物活性先导化合物发现的重要源泉，但也是CYP1B1酶抑制剂的重要来源，故传统中药部分主要有效成分可能具有抑制CYP1B1酶活性的作用，即可能在治疗青光眼时产生一定的拮抗作用。中药泽泻为泽泻科植物东方泽泻（Alisma orientale（Sam.）Juzep.）或泽泻（Alisma plantago-aquatica Linn.）的干燥块茎，其性寒，味甘，归肾经、膀胱经。泽泻具利水渗湿、泄热、化浊降脂功效，属利水渗湿药下分类的利尿通淋药[4-5]，作为治疗青光眼中药处方药中常用配伍药物之一。因此，本研究对具有显著抑制CYP1B1酶活性的泽泻95%乙醇提取物进行化学成分分析。

1 材料和方法

1.1 泽泻95%乙醇提取物抑制CYP1B1酶活性实验

1.1.1 仪器 UPLC-ESI-QTOFMS分析所用仪器为Agiletn公司生产的Agilent UPLC/Q-Tof液质联用仪，仪器型号为Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF。

1.1.2 试药和试剂 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），小鼠肝微粒体（MLM），β-雌二醇，白藜芦醇，乙腈。

1.1.3 实验反应体系 反应体系包含β-雌二醇（20 μM），白藜芦醇（10 μM）或泽泻 95%乙醇提取物（50 μg/mL），MLM（0.5 mg/mL），缓冲液（PBS，pH=7.4）。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式3份。①阳性对照组：同时有白藜芦醇和β-雌二醇。②阴性对照组：没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有β-雌二醇和中药提取物。④空白组：只有β-雌二醇。

1.1.4 液相色谱条件 色谱柱为XDB-C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8mm，Agilent，Santa Clara，CA），紫外检测波长范围为190～400 nm，柱温45℃。流动相A：甲酸/水（0.01/100，v/v），B：甲酸/乙腈（0.01/100，v/v）；流速为0.30 mL/min；梯度洗脱条件：0～12 min，2%～98%B；12～14 min，98%B；14～16 min，98%A。进样量为：5 μL。

1.1.5 质谱条件 质谱分析条件为正离子全扫描模式，扫描范围：50-800 m/z，目标离子为 273.184 9（β-雌二醇）和289.179 8（4-羟基-β-雌二醇）。碰撞气体和干燥气体流速9 L/min。毛细管电压3.5 kV，温度为350℃，雾化压力 35 psi。

1.1.6 多变量数据分析和统计分析 使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件（Agilent，Santa Clara，CA，USA）进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。按下列计算目标化合物的酶活性抑制率。

阳性组或药物组的相对含量=阳性组或药物组的代谢产物的峰面积均值（AS）/空白组的代谢产物的峰面积均值（AC）×100%

CYP1B1酶抑制率（%）=100%-阳性组或药物组的相对含量

P<0.01，具有统计学意义。

1.2 泽泻95%乙醇提取物化学成分的UPLC-ITTOF/MS分析

1.2.1 仪器 LC-MS分析所用仪器为岛津公司（Shimaduz，Kyoto，Japan） 生产的 LCMS-IT-TOF 仪。液相色谱仪控制器型号为CBM-20A，泵型号为LC-30AD，自动进样器型号为SIL-30AC，柱温箱型号为CTO-20AC，脱气装置型号为DGU-20A5，二极管阵列检测器为SPD-M20A。

1.2.2 试药和试剂 泽泻购自昆明市螺蛳湾中药材市场（产自四川），经昆明医科大学唐丽萍教授鉴定为植物泽泻（Alisma plantago-aquatica Linn.）的干燥块茎；色谱纯乙腈购自德国默克公司，超纯水由默克MingCheTM-D24UV设备制备，色谱纯甲酸购自上海阿拉丁试剂公司。

1.2.3 供试品溶液制备 干燥药材泽泻10 g，粉碎，用95%乙醇250 mL浸泡1h，加热至微沸，加热1h，过滤浓缩得浸膏1.8 g。取5 mg浸膏，加入2 mL甲醇超声溶解，于10 000 r/min离心10 min，取上清液进样。

1.2.4 液相色谱条件 色谱柱为UHPLC XB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），紫外检测波长范围为190～400 nm，柱温30℃。流动相A：甲酸/水（0.05/100，v/v），B：乙腈；流速为 0.20 mL/min；梯度洗脱条件：起始梯度为 5%B，0～50 min，5%～90%B；50～55 min，90%B；55～56 min，5%～90%B；56～60 min，5%B。进样量为：2 μL。

1.2.5 质谱条件 质谱条件：离子源为ESI源，三氟乙酸钠校正，电喷雾正负离子同时检测。分析条件如下：喷雾电压为4.50 kV或-3.50 kV；检测电压为1.65 kV；旋转式真空泵压力为71.0 Pa；干燥气压力为110.0 kPa；喷雾气为氮气，流速为1.5 L/min；曲形裂解器（CDL）温度为200℃；加热模块温度为200℃；离子捕获时间为10 ms；母离子选择范围为m/z±3.0 Da；裂解能量（CID）为50%；裂解气为氩气，扫描范围为 m/z 100～1 000。Shimadzu Composition Formula Predictor软件用于预测分子式。

2 结果

泽泻的95%乙醇提取物对CYP1B1酶显示显著抑制活性，其代谢产物4-羟基-β-雌二醇的峰面积分别为0，0，1 164.5，抑制率为93.96%；阳性对照组白藜芦醇的代谢产物4-羟基-β-雌二醇的峰面积分别为 3 946.00，3 469.38，2 851.21；抑制率为 46.72%，空白组的代谢产物4-羟基-β-雌二醇的峰面积分别为6 435.47，6 660.91，6 173.66，均值6 423.35。泽泻的95%乙醇提取物在实验色谱、质谱条件下响应良好，经过分析发现其主要化合物为原萜烷型三萜，保留时间集中在10～50 min之间，最大离子流图（BPC）如图1所示。共分析鉴定了25个原萜烷型三萜类成分，化学结构如图2所示。

图1 泽泻在LC-MS分析条件下的最大离子流图

图2 原萜烷型三萜的结构

LCMS-IT-TOF仪可以测出化合物的精确分子量，Shimadzu Composition Formula Predictor软件结合氮规则的运用可以预测出化合物的准确分子式；通过自动模式选择丰度较高的离子碎片进行碰撞可以给出其二级特征碎片。由高分辨分子量、分子式、多级质谱特征碎片结合Scifinder数据库可以初步推断化合物的基本结构信息，进而快速识别泽泻中的原萜烷型三萜类成分。色谱峰的鉴定结果如表1所示，主要展示色谱峰保留时间、分子量、分子式、二级质谱碎片以及化合物名称等。根据化合物的结构不同，将识别到的色谱峰分为5类，通过不同类型化合物的结构特征来说明其鉴别过程。

表1 泽泻中色谱峰的LC/ESI-MSn鉴定结果

A 型原萜烷型三萜（1～3，5～7，9，14，17，20，22）主要结构特征为C-16位含有羰基，因此与C-13和C-17位之间的双键形成了α，β不饱和酮结构，有一定的紫外吸收，侧链的C-23，C-24和C-25位一般有羟基或者乙酰氧基取代，部分化合物在C-24和C-25位之间形成了三元氧化，不含环氧环的为A1型，含有环氧环的为A2型。对于A1型化合物而言，较容易失去侧链的取代基，尤其是含有乙酰氧基的时候最容易失去，形成基峰离子，然后失去C-23位的侧链形成含26个碳原子的碎片离子。以色谱峰1为例，在正离子模式下最容易检测到其[M+H]+和[M+Na]+离子，分别为m/z 505.351 5和527.339 9，预测其分子式为C30H48O6，以m/z 505.351 5为母离子进行轰击，检测到依次失去3个羟基，即脱去3分子H2O 的碎片，分别为 m/z 487.341 7（C30H46O5，-0.1），469.337 1（C30H44O4，+5.9）和 451.317 4（C30H42O3，-3.3），对应于原萜烷型三萜侧链上3个羟基的丢失，同时还生成基峰离子m/z415.2853（C26H38O4，+1.0），对应 C-23位侧链的整体丢失；通过查阅文献[6-8]比对，泽泻中化合物16-氧代-泽泻醇A（16-oxoalisol A）满足该裂解条件，因此将色谱峰1鉴定为16-氧代-泽泻醇A（16-oxoalisol A）。对于A2型化合物而言，因为侧链三元环氧环的存在，不容易检测到连续失去羟基的碎片，如色谱峰20，高分辨质谱测得其[M+H]+和[M+Na]+离子分别为m/z 545.348 0和567.329 5，预测其分子式为C32H48O7，检测到失去乙酰氧基的基峰离子碎片m/z 467.326 0（C30H42O4，+10.4），推测该化合物含有乙酰氧基，同时碎片离子 m/z 387.248 2（C24H34O4，-4.8）的丰度也较高，推测为C-20位侧链丢失产生，经查阅文献[9]，化合物23-乙酰泽泻醇M（Alisol M 23-acetate）的裂解行为与之相符，因此色谱峰20鉴定为23-乙酰泽泻醇M（Alisol M 23-acetate）。图3展示了色谱峰1和20的裂解途径。

图3 正离子模式下16-oxoalisol A，alisol M 23-acetate和alisol A的裂解途径

B 型原萜烷型三萜（11～13，15，18，21，23，25）C-16不含氧原子取代，因此与C-13和C-17位之间的双键无法形成α，β不饱和酮结构，紫外吸收较弱，与A型相似，该类型化合物侧链的C-23，C-24和C-25位一般有羟基或者乙酰氧基取代，部分化合物在C-24和C-25位之间形成了三元氧化，不含环氧环的为B1型，含有环氧环的为B2型。这类型化合物在泽泻乙醇提取物中含量较高，因此色谱峰响应较好，检测较多的离子碎片。色谱峰12检测到其[M+Na]+峰为m/z 513.350 0[M+HCOO]-峰为m/z 535.356 8（-7.2），因此预测其分子式为 C30H50O5，m/z 473.363 3（C30H48O4，-4.9），455.349 2（C30H46O3，-2.8）和 437.336 9（C30H44O2，-4.5）是连续失去3个羟基产生的碎片，m/z 365.281 3（C26H36O，-2.6）为失去 C-23 侧链生成的碎片，这些裂解行为与泽泻醇 A（Alisol A）[7，10]相符，因此色谱峰12被鉴定为泽泻醇A（Alisol A）。图3展示了色谱峰12的裂解途径。

C型原萜烷型三萜（8，24）的主要结构特征为C-16位被过氧基或者乙氧基取代，因此该类型化合物的主要质谱裂解特征行为就是C-16位取代基的丢失，色谱峰8和24分别检测到失去过氧基和乙氧基的碎片离子 m/z 455.281 5（C30H40O2，-10.6）和475.346 2 （C30H44O3，+7.8），因此其结构得以鉴定。

D型原萜烷型三萜（16，19）在C-16位和C-23位之间形成了六元氧环，因此侧链的裂解基本都是在C-23位，形成含有26个碳原子的碎片离子m/z 439.266 3(C26H40O4，-15.6）和 421.276 1（C26H38O3，+4.8），通过这些特征碎片可以鉴定色谱峰16和19的结构。

E型原萜烷型三萜（4，10），其C-13位和C-17位之间未能形成双键，被环氧环或者羟基取代，这类型化合物除了侧链基团的裂解外，C-13位和C-17位之间的环氧环或羟基也能裂解，形成特征的质谱碎片，结合数据库搜索[11-12]，可将其结构初步鉴定。

3 结论

中药泽泻是最常用的中药之一，近代药理研究证明，泽泻具有抗炎、利尿、降血压、降血脂、抗乙型肝炎病毒、抗脂肪肝等作用；原萜烷型三萜和倍半萜类是泽泻的主要化学成分[13-18]。本文通过CYP1B1酶活性实验发现，泽泻的95%乙醇提取物对CYP1B1酶抑制率为93.96%，显示显著抑酶活性。通过LC-MS分析，发现其主要化合物为原萜烷型三萜，且在ESI源下以正离子模式响应较好，其二级质谱碎片也较为丰富，较易检测到[M+H]+和[M+Na]+离子，负离子模式下[M+HCOO]-离子的丰度最高。通过以[M+H]+或[M+Na]+离子作为母离子进行轰击，其主要裂解途径为失去侧链的羟基或者乙酰氧基，同时C-20或者C-23位侧链也容易失去，形成含有24或者26个碳原子的离子碎片，为色谱峰的质谱鉴定提供了丰富的信息；通过将化合物的结构进行分类，总结其质谱裂解规律，为进一步通过LC-MS靶向研究泽泻的生物活性成分提供了依据。