砂仁复方对5-FU所致大鼠肠道菌群调节作用研究*

李 菊，赵荣华，陈 鑫，何玉潇，牛璐璐，孙瑞芬

（云南中医药大学，云南 昆明 650500）

恶性肿瘤严重威胁着全球公众的生命健康，是全世界亟待解决的健康问题，在我国肿瘤死亡占全部死因的1/4[1]。肿瘤控制已经成为世界各国政府的卫生战略重点[2]。肿瘤治疗最主要的手段为手术及放化疗，而化疗药物的长期使用会产生一系列的毒副反应，影响患者生存质量甚至危及患者生命[3-5]。而胃肠道反应是化疗后主要不良反应之一，除了常见的恶心、呕吐等症状外，化疗药物能引起腹胀、腹泻、食欲减退、便秘，并能直接杀伤肠腔正常菌群，破坏肠道菌群稳态[6-8]。如何缓解化疗患者胃肠反应，并保持肠道菌群的平衡，成为了肿瘤化疗能否耐受的关键环节。

中医治疗胃肠道疾病具有较好的疗效[9]。砂仁复方以砂仁为主，辅以人参、滇黄精制成。砂仁为豆蔻属多年生草本植物，在临床上具有保护胃粘膜、改善胃肠机能、止痛、止泻、促进消化液的分泌、调节肠道微生物菌群等作用[10-12]。人参具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津止渴，安神益智的功效[13]。现代药理学研究证明人参具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗炎、杀菌等[14]。黄精为百合科植物滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎，具有滋肾润肺，补脾益气的功效[15-16]。砂仁复方对5-FU导致的胃肠菌群失调可能具有调节作用，但尚无确切的研究证明。本文利用5-FU建立大鼠肠道菌群失调模型，不同剂量砂仁复方灌胃，研究砂仁复方保护化疗药物5-FU所致大鼠肠道菌群失调作用，为临床肿瘤治疗中5-FU应用提供支撑，为砂仁复方的开发利用提供一定科学依据，同时为云南砂仁产业化发展作出贡献。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品、样本 雄性清洁级SD大鼠，体质量180～200 g，购于昆明医科大学实验动物学部，许可证号：SCXK（滇）k2015-002；砂仁（姜科植物砂仁Amomun villosum Lour的干燥成熟果实）；人参（五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey）和黄精（百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl）均购于昆明市螺蛳湾中药材市场，3种药材经云南中医药大学赵荣华教授鉴定为正品；双歧杆菌四联活菌片（思连康）产于杭州远大生物制药有限公司，批号：201703101；五氟尿嘧啶（5-FU）产于北京华迈科生物技术有限责任公司，批号：BJ160513212A；大鼠粪便（实验结束当天收集鼠便，液氮速冻过夜，后转移至-80℃冰箱贮存，备用）。

1.2 实验方法

1.2.1 砂仁复方溶液的制备、动物分组及给药 砂仁复方为砂仁、滇黄精、人参按1∶1∶1比例配伍而成，滇黄精用其提取液制成1 mL相当于1 g生药流浸膏备用。砂仁、人参分别粉碎过100目筛备用。根据复方砂仁人服用每日剂量，折算大鼠的等效剂量约为生药1.6 g/kg，为本实验的中剂量，同时分别以生药0.8、3.2 g/kg作为低剂量和高剂量。再配制0.32 g/mL砂仁复方高剂量药液、0.16 g/mL砂仁复方中剂量药液、0.08 g/mL砂仁复方低剂量药液。

SD大鼠，随机分成6组，每组9只：正常组（CON）、模型组（MOD）、阳性药思连康组（BQVT）、砂仁复方低剂量组（AVCP-L）、砂仁复方中剂量组（AVCP-M）、砂仁复方高剂量组（AVCP-H）。

动物模型及各组给药依据课题组前期实验研究及杜静等的方法，CON组每天1次生理盐水灌胃（1 mL/100 g）至第19天，MOD组每天灌胃生理盐水至第19天，并于第8、14天灌胃生理盐水4 h后腹腔注射5-FU（35 mg/kg）。BQVT组每天灌胃生理盐水至第7天，并于第8天开始灌胃思连康（0.45 g/kg），每天1次至第19天，且于第8、14天给药4 h后，各腹腔注射 5-FU（35 mg/kg）1次。AVCP-L 组、AVCP-M组、AVCP-H组每天1次灌胃相应剂量的砂仁复方药液，并在第8、14天给药4 h后各腹腔注射5-FU（35 mg/kg）1次。于第19天收集每组3只大鼠粪便作为处理样品，液氮速冻过夜，后转移至-80℃冰箱贮存，备用。

1.2.2 SD大鼠粪便细菌16S rRNA测序 大鼠粪便样品进行DNA提取，将细菌的16S rRNA（核糖体小RNA）基因V3可变区序列作为通用引物进行扩增，以引物 338F_806R （338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）进行PCR扩增。由美吉生物进行16S rRNA V3区测序得到有效数据（Effective Tags）上传至i-Sanger生物信息云平台。

1.2.3 运用i-Singer云平台分析16S rRNA测序数据根据i-Singer云平台分析软件对各处理组肠道粪便菌群物种进行分析、注释，对肠道菌群物种多样性、不同分类学水平下菌群丰度分析进行分析比较，评价砂仁复方对化疗药5-FU所致大鼠肠道菌群变化的影响。

2 结果

2.1 肠道菌群丰度及Alpha多样性分析 经测序分析，18份粪便样品共获得675 236条优化序列，序列平均碱基长度为440 bp，按照有效序列数以97%的序列一致性，将序列共聚类成3 933个操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）。各组样品的 OUT数量及多样性指数见表1。各组OUT数量存在差异，AVCP-M>MOD>AVCP-H>AVCP-L>BQVT>CON。其中MOD的OTU数量显著高于CON（P<0.05），AVCP-M、AVCP-H的OTU数量显著高于CON（P<0.05）。丰度指数（Chao1）能估计菌群物种数，各组Chao1指数：MOD>AVCP-M>AVCP-H>AVCP-L>BQVT>CON，MOD及AVCL.M的Chao1指数均显著高于正常组（P<0.05）。辛普森指数（Simpson）用来估算样品中微生物多样性的指数，指数越大，物种多样性则越小，各组Simpson指数：MOD>CON>AVCP-H>BQVT>AVCP-L>AVCP-M，其中MOD的Simpson指数显著高于 AVCP-L、AVCP-M（P<0.05）。

表1 样品的OUT数量及多样性指数表（±s，n=3）

表1 样品的OUT数量及多样性指数表（±s，n=3）

注：与正常组相比，▲P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。

A l p h a多样性指数组数 O T U数量丰度指数C h a o 1 辛普森指数S i m p s o n正常组 C O N 4 3 7.6 7±6 7.0 0 5 0 9.6 2±7 9.0 4 0.0 7 9±0.0 3 1模型组M O D 5 1 6.0 0±3.6 1▲ 6 1 6.4 3±3 7.2 0▲ 0.1 0 0±0.0 6 8思连康阳性组 B Q V T 4 6 3.0 0±1 3.5 0 5 4 0.7 7±4 0.4 7 0.0 5 0±0.0 2 2砂仁复方低剂量 A V C P-L 5 0 6.6 7±1 1.5 0 5 9 2.5 0±2 6.9 3 0.0 3 6±0.0 1 4*砂仁复方中剂量A V C P-M 5 1 9.0 0±5 3.0 0▲ 6 1 2.7 8±5 8.6 8▲ 0.0 3 2±0.0 0 5*砂仁复方高剂量 A V C P-H 5 1 5.6 7±4 0.0 0▲ 5 9 3.1 2±6 2.8 5 0.0 7 4±0.0 2 2

2.2 稀释曲线 以抽到的序列数同其所代表的OUT数构建稀释曲线，如图1所示，曲线未进入平台期，说明随着测序条数的增加，仍会产生新的OUT。以各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建维纳指数（Shannon）曲线，如图2所示，曲线已趋于平坦，表明尽管随着测序量的增加，新的物种可能会出现，但微生物的多样性已经不再随之发生变化。说明本次测序数据量合理，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。

图1 稀释曲线SD大鼠粪便样品Sobs稀释曲线图

图2 多样性曲线大鼠粪便样品Shannon稀释曲线图

2.3 各分类学水平下相对丰度分析

2.3.1 门水平上各个处理组肠道菌群分析 表2所示，各处理组大鼠粪便微生物的16S rRNA进行测序，在被检测出的10个菌门中，绝大多数（>95%）属于拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）。

表2 主要菌门在各组的相对丰度表（±s，n=3，%）

表2 主要菌门在各组的相对丰度表（±s，n=3，%）

注：与正常组相比，▲P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。

组别 拟杆菌门 厚壁菌门 厚壁菌门/拟杆菌门正常组 C O N 5 4.0 2 0 0±7.1 0 5 4 4 4.3 7 0 0±7.3 3 5 5 0.8 4 4 7±0.2 6 6 1 1模型组 M O D 6 2.9 0 3 3±8.2 3 4 0▲ 3 2.6 0 6 7±8.3 1 8 7▲ 0.5 3 5 6±0.1 9 7 5 3▲思连康阳性组 B Q V T 6 1.7 9 6 7±1 1.2 8 4 0 3 5.5 8 6 7±1 0.8 9 2 1 0.6 1 3 8±0.3 1 2 4 7砂仁复方低剂量 A V C P-L 5 6.8 1 3 3±7.8 4 3 1* 4 0.9 3 6 7±6.2 5 7 6* 0.7 4 1 4±0.2 2 6 3 5*砂仁复方中剂量 A V C P-M 5 8.5 2 0 0±7.6 7 2 5* 3 9.2 8 6 7±7.3 2 5 2* 0.6 9 1 3±0.2 3 0 2 2*砂仁复方高剂量 A V C P-H 6 2.4 0 6 7±9.2 2 2 0 3 3.8 1 3 3±7.7 2 6 0 0.5 6 3 5±0.2 2 0 9 6

厚壁菌门（Firmicutes）的构成比例：CON>AVCPL>AVCP-M>BQVT>AVCP-H>MOD，和拟杆菌门（Bacteroidetes）的构成比例刚好相反。厚壁菌门/拟杆菌门之比[Firmicutes（%）/Bacteroidetes（%）]：CON>AVCP-L>AVCP-M>BQVT>AVCP-H>MOD。

2.3.2 科水平上各个处理组肠道菌群分析 如表3所示，在被检测出的42个菌科中，对各样品中丰度大于95%的科进行了统计，小于5%的计入其它。所有粪便样品的处理组中，相对丰度较高的科共检测到7个。厚壁菌门芽孢杆菌纲：乳杆菌科（Lactobacillaceae）；厚壁菌门梭菌纲：消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）；拟杆菌门拟杆菌纲：拟杆菌科（Bacteroidaceae）、拟杆菌科（Bacteroidales-S24-7-group）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）。

表3 各组主要菌科相对丰度表（±s，n=3）

表3 各组主要菌科相对丰度表（±s，n=3）

注：与空白组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

组别 乳杆菌科 消化链球菌科 瘤胃菌科 毛螺菌科 拟杆菌科 拟杆菌科_S 2 4-7_g r o u p 普雷沃氏菌科C O N 0.2 8 2 9±0.0 9 0 6 0.0 0 9 3±0.0 0 2 6 0.0 5 9 3±0.0 0 0 4 0.0 8 3 2±0.0 3 8 1 0.0 5 4 0±0.0 3 8 2 0.2 1 7 1±0.0 3 3 6 0.2 5 5 8±0.0 5 4 2 M O D 0.0 8 6 1±0.0 8 1 9▲0.0 0 2 4±0.0 0 1 8 0.1 1 0 3±0.0 3 2 3 0.1 1 0 7±0.0 7 4 5 0.0 3 5 8±0.0 0 6 9 0.1 4 7 5±0.0 3 8 9 0.4 2 7 7±0.1 2 7 4▲B Q V T 0.1 7 6 5±0.1 3 6 8 0.0 0 5 4±0.0 0 3 0 0.0 9 5 8±0.0 1 9 5 0.0 6 5 7±0.0 1 6 1 0.0 6 1 8±0.0 2 2 6 0.2 2 6 6±0.1 5 2 1 0.3 1 3 6±0.0 9 5 3 A V C P-L 0.1 5 3 7±0.1 0 5 8 0.0 0 9 4±0.0 0 6 9 0.0 7 4 1±0.0 1 2 8 0.1 6 2 6±0.1 0 3 5 0.0 4 9 2±0.0 2 7 6 0.2 7 8 5±0.1 2 8 3 0.2 2 7 0±0.0 4 9 1*A V C P-M 0.0 7 1 6±0.0 2 6 4▲0.0 3 8 6±0.0 2 5 8▲▲**0.1 0 7 8±0.0 2 7 9 0.1 6 2 6±0.0 5 8 3 0.0 6 3 1±0.0 2 2 4 0.2 3 1 8±0.0 4 8 3 0.2 7 5 6±0.0 5 7 8 A V C P-H 0.0 6 6 5±0.0 4 8 0▲0.0 0 5 0±0.0 0 3 2 0.1 4 5 0±0.0 7 0 0▲ 0.0 9 2 7±0.0 5 1 9 0.0 4 3 9±0.0 2 0 9 0.1 4 4 0±0.0 0 6 7 0.4 2 2 3±0.1 0 3 0▲

乳杆菌科（Lactobacillaceae，属厚壁菌门）比例：CON>BQVT>AVCP-L>MOD>AVCP-M>AVCP-H；MOD、AVCP-M、AVCP-H 3组乳杆菌科（Lactobacil laceae）的比例显著低于 CON（P<0.05）；BQVT、AVCPL和CON 3组乳杆菌科（Lactobacillaceae）构成比例没有差异性（P>0.05）。

消化链球菌科（Peptostreptococcaceae，属厚壁菌门）比例：AVCP-M>AVCP-L>CON>BQVT>AVCP-H>MOD；AVCP-M 中消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）的相对丰度均显著大于 CON、MOD（P<0.01）。

瘤胃菌科（Ruminococcaceae，属厚壁菌门）比例：AVCP-H>MOD>AVCPM>BQVT>AVCP-L>CON；AVCP-H瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的相对丰度显著大于CON（P<0.05）；且AVCP-H的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相对丰度也显著大于AVCP-L（P<0.05）。

普雷沃氏菌科（Prevotellaceae，属拟杆菌门）比例：MOD>AVCP-H>BQVT>AVCP-M>CON>AVCP-L。同CON相比，MOD、AVCP-H两组普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相对丰度显著大于 CON（P<0.05）；和MOD相比，AVCP-L普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相对丰度显著小于MOD（P<0.05）。

毛螺菌科（Lachnospiraceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、拟杆菌科 _S24-7_group（Bacteroidales_S24-7_group）3个菌科构成比例各组之间并没有显著性差异（P>0.05）。

2.3.3 属水平上各个处理组肠道菌群分析 在被检测出的121个菌属中，对各样品中丰度大于95%的科进行了统计，小于5%的计入其它。所有粪便样品的处理组中，相对丰度较高的属共检测到13个，如图3所示。

图3 各处理组在属水平上的丰度

CON组的优势菌属：乳杆菌属（Lactobacillus 28.29%）、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（21.71%）；MOD组的优势菌属：Prevotella_9（22.2%）、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（14.75%）；BQVT组的优势菌属：norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（22.66%）、Lactobacillus（17.65%）；AVCP-L 组主要优势菌属：norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（27.85%）、Lactobacillus（15.37%）；AVCP-M 组主要优势菌属：norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（23.18%）；AVCP-H组主要优势菌属：Prevotella_9（16.50%）、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（14.40%）；与CON组相比，化疗药5-FU组所致大鼠普雷沃菌属Prevotella_9相对丰度增加明显，乳杆菌属Lactobacillus明显降低，一个未知门类的菌属norank_f_Bacteroidales_S24-7_group降低。与CON组相比，BQVT、AVCP-M普雷沃菌属Prevotella_9相对丰度降低，AVCP-L普雷沃菌属Prevotella_9比例增加。与CON组相比，其它各组乳杆菌Lactobacillus比例均降低，BQVT和AVCP-L的下降幅度低于其它各组。乳杆菌属Lactobacillus的相对丰度：CON>BQVT>AVCP-L>AVCP-H>MOD>AVCP-M；和CON组相比，MOD（P<0.05）、AVCP-H（P<0.05）、AVCP-M（P<0.01）3组Lactobacillus属的比例显著低于空白组，BQVT及AVCP-L和空白组乳杆菌属Lactobacillus的比例和CON没有差异性（P>0.05）；对比CON，BQVT、AVCP-L及AVCP-M中1个未知门类的菌属norank_f_Bacteroidales_S24-7_group的相对丰度增加，且AVCP-L组的增幅最大。

2.3.4 样本层级聚类分析 如图4可知：CON（A5、A2、A8）聚为一簇，模型组 MOD（B3、B1、B2）聚为一簇，且CON和MOD距离最远；其它各组呈分散型介于二者之间，其中砂仁复方低剂量组AVCP-L（F8、F10、F1）、阳性药思连康组 BQVT（C6、C4、C1）距离相对空白组CON的距离最近。

图4 各组粪便菌群OTU水平上的样本层级聚类分析

3 讨论

健康肠道中微生物组成稳定、多样性较高，饮食结构、药物诱导等因素会对肠道微生物造成不同程度的影响，引起肠道菌群、多样性改变等，可能引发不同疾病，溃疡性结肠炎患者的肠道菌群物种数及多样性都显著低于健康人体[17]。本研究显示，化疗药5-FU所致大鼠SD大鼠OTU数显著大于正常SD大鼠；但化疗药5-FU所致大鼠的Simpson指数大于空白组，提示化疗药5-FU所致大鼠物种数增加，但物种多样性低于空白组。

OUT数和Alpha多样性指数能反应肠道菌群的数量及菌群的多样性[18-19]，Huang Y[20]等采集白血病儿童肠内容物进行16S rRNA测序，发现白血病患儿OTU数等指数均显著低于健康人群；本研究中OUT数和Alpha多样性指数中Chao1指数分析结果几乎吻合，由OUT数、Chao1指数分析表明MOD、AVCPM的物种数明显高于CON；由Simpson指数，得出AVCPM、AVCP-L肠道菌群物种多样性显著高于MOD。提示化疗药5-FU所致大鼠肠道物种数明显增加，但肠道菌群多样性低于其它所有实验组，且明显低于砂仁复方低剂量组及砂仁复方中剂量组。

5-FU所致大鼠肠道粪便菌群拟杆菌门（Bacteroidetes）比例增加、厚壁菌门（Firmicutes）的比例减少、厚壁菌门/拟杆菌门[Firmicutes（%）/Bacteroidetes（%）]之比降低；这与陈晓慧[21]等的研究化疗后，伴随着肠道黏膜炎的发生，肠道菌群的种类和比例发生了显著的变化，拟杆菌、肠杆菌等厌氧菌数量增加具有一定统一性。AVCP-L拟杆菌门（Bacteroidetes）比例、厚壁菌门（Firmicutes）的比例、厚壁菌门/拟杆菌门之比[Firmicutes（%）/Bacteroidetes（%）]之比都更接近CON，表明砂仁复方低剂量可能具有一定调节化疗后拟杆菌门、厚壁菌门作用，并使之接近空白组。

砂仁复方中剂量可以显著性调高化疗药5-FU所致Peptostreptococcaceae相对丰度的降低，并显著高于MOD及CON；阳性药思连康、砂仁复方低、高剂量对化疗药5-FU所致Peptostreptococcaceae相对丰度的降低也具有一定调节作用。孙志高[22]等认为，化疗后肠道益生菌数量（丰度）减少。这与本实验结果化疗药5-FU所致大鼠乳杆菌科相对丰度明显低于CON具有一致性；阳性药思连康和砂仁复方低剂量可能具有一定调高化疗药5-FU所致大鼠乳杆菌科（Lactobacillaceae）比例，使之接近正常水平。化疗药5-FU所致大鼠普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相对丰度明显增加，且砂仁复方低剂量可以显著性降低5-FU腹腔注射后普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）比例的升高。砂仁复方低剂量可能主要通过调高乳杆菌科（Lactobacillaceae）、消化链球菌科比例以及降低瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的比例来调节厚壁菌门的平衡；普雷沃菌属普雷沃菌属与抗生素相关性腹泻（AAD）的发生和治疗密切相关[23]。乳酸杆菌一直被认为是维持肠道健康的典型有益菌，可以促进乳糖不耐受人群消化乳糖、减少便秘和腹泻、抑制肠道感染、减轻炎症反应等[24]。相对于健康人群，克罗恩病患者粪便中瘤胃球菌数量增多[25]，本研究中，和空白组相比，其它实验组瘤胃球菌数量均有不同程度的增加。同时，砂仁复方低剂量还能显著性降低普雷沃氏菌科厌氧致病菌的比例，维持肠道微生态的平衡。另外，砂仁复方中剂量对消化链球菌科化疗后比例降低有显著的调高作用，并高于空白组。阳性药思连康对益生菌乳杆菌科（属厚壁菌门Lactobacillaceae）化疗后比例降低的调高作用优于砂仁复方低剂量。

吴英韬[26]等的研究益生菌混合液对5-FU腹腔注射SD大鼠肠道菌群的调节作用，显示聚类分析5-FU腹腔注射模型组单独归为一类，空白组及益生菌低剂量、益生菌高剂量归为一类；与本研究聚类分析发现化疗药5-FU所致大鼠单独归为一类、空白组也单独归为一类、其它组介于二者之间；化疗药5-FU所致大鼠肠道菌群物种多样性降低具有一致性。本研究样本层级聚类分析可以看出，砂仁复方复方低、中剂量、阳性药思连康对化疗药5-FU所致大鼠普雷沃菌 属 Prevotella_9、 乳 杆 菌 属 Lactobacillus、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group相对丰度的变化，具有一定调节作用。阳性药思连康和砂仁复方低剂量对化疗药5-FU所致大鼠Lactobacillus属相对丰度显著降低，具有明显抑制作用。

Fang W[27]等研究葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的BALB/c小鼠结肠炎模型中肠道菌群多样性降低、革兰氏阴性菌增多。与本研究中5-FU所致大鼠norank_f_Bacteroida-les_S24-7_group比例降低32.06%，肠道菌群多样性降低等具有一致性。故砂仁复方对化疗药5-FU所致大鼠肠道菌群多样性降低等均具有明显调节作用。