基于PI3K/Akt信号通路探讨活血通络法对膝骨关节炎小鼠细胞凋亡和相关蛋白水平表达的影响*

吕 静 ，李具宝 ，廖建青 ，何渝煦 ，王 琦 △，李 波

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500； 2.云南中医药大学第一附属医院/云南省中医医院，云南 昆明 650021）

膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以关节肿胀、僵硬、活动受限等为主要临床表现，具有高致畸率和致残率的慢性、进行性疾病[1-2]。该病患病率与年龄成正相关，在60岁及其以上的老年人，近一半有骨关节炎的X线表现[3-4]。随着我国人口老龄化的加重，KOA发病率也随之上升。目前，KOA病因及病理机制尚未完全明晰[5]，近年来，信号通路在KOA软骨细胞增殖、凋亡和发病机制和靶向治疗研究方面也逐渐起步[6]，相关研究表明PI3K/AKT信号传导通路在KOA发病机制中尤为重要，对软骨细胞增殖、凋亡有重要的调控作用[7]。中医药治疗KOA独特优势日益显著[8-12]。我院骨伤科在多年的临床经验和文献查阅的基础上，以活血通络为治法运用骨痹合剂治疗膝骨关节炎具有良好的疗效。经前期临床试验和基础研究表明[13-14]，以活血通络法为治法的骨痹合剂能有效改善软骨退变中的软骨基质代谢、抑制氧自由基损伤。本研究通过观察骨痹合剂对小鼠PI3K/AKT通路中关键调控因子Bad、Caspase-3、Caspase-9和NF-κB的mRNA和蛋白的表达探讨具有活血通络作用的骨痹合剂治疗KOA的作用机理，为临床治疗提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级C57雄性小鼠60只，体质量（19.58±0.6）g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，许可证号：SCXK（苏）2017-0001。小鼠生长条件为室温（22±1）℃，相对湿度为38%～48%，每天日照时间为12 h。

1.2 实验药物 ①骨痹合剂（滇药制字（Z）04A01888）由云南中医药大学第一附属医院/云南省中医医院制剂室提供；②氨糖美辛肠溶片（国药准字H44022796）购买于上海华中药业有限公司。

1.3 实验试剂 苏木素（珠海贝索，批号：BA4097）；伊红染液（珠海贝索，批号：BA4099）；中性树胶（国药集团化学试剂有限公司，批号：10004160）；Trizol（Takara，批号：9108）；Nanodrop（Thermo fisher，2000）；DEPC（上海阿拉丁生化，批号：D105557）；RIPA（碧云天生物技术有限公司，批号：P0013B）；蛋白酶抑制剂cocktail（瑞士 Roche，批号：4693116001）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，批号：P0010）；盐酸（国药集团化学试剂有限公司，批号：7647-01-0）；EDTA抗原修复液（福州迈新生物技术开发有限公司，批号：NVS-0099）；兔二抗（丹麦 Dako公司，批号：K4003）；鼠二抗（丹麦Dako公司，批号：K4001）；DAB显色剂（丹麦Dako公司，批号：K3468）；SYBR®Premix Ex Taq（日本 Takara公司，批号：RR820A）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本Takara公司，批号：RR047A）。

1.4 仪器 组织脱水机（常州普瑞斯星医疗器械有限公司，型号：PQT-A）；组织包埋机（常州普瑞斯星医疗器械有限公司，型号：PBM-A）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2235）；组织摊片机（常州普瑞斯星医疗器械有限公司，型号：PHY-Ⅲ）；烤箱（天津泰斯特仪器有限公司，型号：WGL-125B）；显微镜（日本尼康公司，型号：H550S）；显微镜成像系统（日本尼康公司，型号：DS-RI2）；PCR仪（美国Applied biosystems公司，型号：Veriti）；紫外-可见光分光光度计（美国Thermo fisher公司，型号：Nano drop 2000）

2 方法

2.1 动物模型制备 本次实验所用的60只SPF级小鼠均采用Hulth法制备KOA模型，麻醉方式为4%戊巴比妥钠腹腔麻醉，首先于小鼠腿部膝关节处备皮消毒，由髌旁内侧切口显露髌骨向外侧脱位，手术刀切断前交叉韧带，止血后将髌骨复位，关节腔逐层闭合。术后为预防感染，予每只小鼠肌肉注射青霉素钠（3×104U）连续3 d。

2.2 动物分组及给药 造模成功后的60只SPF级小鼠随机分为3组，每组各20只，分别为骨痹合剂组、氨糖美辛组、生理盐水组，适应性喂养1周后开始干预。骨痹合剂组以骨痹合剂13 mL/（kg·次）灌胃，氨糖美辛组将“氨糖美辛肠溶片”溶解于等体积蒸馏水19.5 mg/（kg·次）灌胃；对照组以同体积生理盐水灌胃，每日上午、下午各1次，连续灌胃8周。

2.3 取材 连续8周灌胃后，小鼠予戊巴比妥钠腹腔过麻处死。取双下肢，去除皮肤和肌肉，分离膝关节并保留其相连的胫骨和股骨，取双下膝关节软骨检测。将左膝关节甲醛固定，右膝关节于体式显微镜下剥离膝关节软骨，-80℃保存。

2.4 组织石蜡包埋切片 将小鼠关节软骨的新鲜组织用4%多聚甲醛固定，24 h后将组织置于脱水盒内进行脱水，随后将浸好蜡的小鼠膝关节组织进行包埋，于-20℃冷台冷却，等待蜡凝固后将蜡进行修整，将蜡块切至为4 μm的薄片。

2.5 HE染色 依次将备好的切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ溶液各20 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各10 min，梯度酒精各5 min，随后使用蒸馏水洗将切片净。经过苏木素染核，盐酸乙醇分化，氨水返蓝后流水冲洗。切片入伊红染液染细胞质，中性树胶封片。

2.6 免疫组化检测 切片脱蜡至水后放置于EDTA抗原修复液中修复，待修复后放入3%过氧化氢溶液中予室温避光孵育10 min，于血清封闭液室温封闭20 min。一抗4℃过夜，二抗室温孵育1 h，DAB显色后显微镜控制显色，苏木素复染细胞核。脱水干燥，运用二甲苯透明，使用中性树胶封固。

2.7 PCR检测 将软骨置于液氮研钵中磨成粉状，加入Trizol提取总mRNA，据nano drop测定RNA样品浓度。按照试剂盒说明书合成cDNA，并进行逆转录PCR反应。以GAPDH作为内参。反应条件为预变性 95 ℃、2 min，变性 95 ℃、15 s，退火 60 ℃、30 s，延伸60℃、1 min。总共45个循环。经2-△△CT处理数据分析相对表达量。

2.8 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件分析，实验计量资料以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用t检验，P<0.05为差异存在统计学意义。

3 结果

3.1 形态学改变 可见对照组软骨表面缺损且软骨细胞数量明显减少，且软骨表面粗糙；与生理盐水组比，骨痹合剂组和氨糖美辛组较软骨组织有明显改善，软骨表面细微裂隙减少，软骨细胞数目增加；氨糖美辛组与骨痹合剂组未见明显差异。见图1。

图1 各组软骨组织HE染色形态学比较（×200）

3.2 免疫组化 Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB蛋白检测结果 可见生理盐水组中软骨表面4种蛋白均高表达；与对照组相比，两用药组软骨组织中4种蛋白表达均降低（P<0.01或P<0.05）。见图2-5、表 1。

图2 各组软骨组织Bad蛋白表达比较

表1 各组软骨组织蛋白表达IOD值（±s，n=3）

表1 各组软骨组织蛋白表达IOD值（±s，n=3）

注：与生理盐水组比较，*P<0.01，**P<0.05.

项目 B a d C a s p a s e-3 C a s p a s e-9 N F-κ B生理盐水组 5 0 3 7±8 6 9 5 1 9 0±8 7 6 5 4 2 1±9 1 4 5 6 2 6±7 1 8骨痹合剂组 3 0 5 6±7 7 9*3 1 5 1±9 0 6*3 3 7 3±7 4 2*3 3 8 1±6 7 6*氨糖美辛组 3 3 3 2±7 2 3 3 2 7 9±9 4 3 3 2 8 3±7 3 7*3 4 5 7±7 5 1*

图3 各组软骨组织Caspase-3蛋白表达比较

图4 各组软骨组织Caspase-9蛋白表达比较

图5 各组软骨组织NF-κB蛋白表达比较

3.3 PCR 检测 Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB mRNA 与生理盐水组比较，骨痹合剂组和氨糖美辛组小鼠关节软骨中 Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB mRNA表达均显著降低（P<0.01或P<0.05）。两用药组之间未见明显差异。见图6。

图6 各组软骨组织Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB mRNA表达比较

4 讨论

4.1 KOA与活血通络法的关系 在《内经》中记载的痹病种类繁多，诸如五脏痹、六腑痹、节痹等，根据分析，临床表现为膝关节疼痛、肿胀、僵硬、活动不利的KOA当属于五体肢节痹中“骨痹”范畴[15]。《医林改错》中提出“瘀血导致痹病”的理念；《灵枢·本脏》中提出“经脉者，所以行血气而营阴阳，濡筋骨，利关节也。血和而经脉流行……筋骨劲强，关节清利矣”，认为瘀血阻滞、气血不行、关节筋骨失于润养而发病；《类证制裁·痹症》云：“由营卫先虚，腠理不密，风寒湿乘虚内袭，正气为邪所阻，不能宣行，因而留滞，气血凝涩，久而成痹。”指出正气亏虚，无力抵御外邪入侵，导致气血凝滞阻塞脉络，久而成痹；《张氏医通》又载：“膝痛无有不因肝肾虚者，虚则风寒湿袭之”[16]。综上所述，膝痹病的内因多由于肝肾气血亏虚，筋骨失荣，气虚血瘀痹阻于局部经络；外因多是由风、寒、湿邪壅塞经络，气血凝滞所致[17]。瘀血被认为是本病发生的关键病机，瘀血为骨关节炎的病理因素。我院骨伤科王琦教授在多年来运用中医药治疗膝骨关节炎的临床经验以及对于文献、古籍查阅学习的基础上，认为“调节气机”与“通达经络”为治疗痹证的关键。“气为血之帅，血为气之母”，气血关系密切，活血以行气，故活血为调节气机的关键。《灵枢·经脉》云：“经脉者，所以决死生，处百病，调虚实，不可不通[18]。”而瘀血痹阻经络，不通则通，因此痹证会表现为疼痛、屈伸不利等症状。经络调达内外上下，是运行气血的通道，基于此，王琦教授认为通达经络是治疗骨性关节炎的关键。只有将经络调节平衡，气血才得以运行，通则不痛。调节气机与通达经络相辅相成，共同起到活血通络之功。以此思路为基础，研发了骨痹合剂。骨痹合剂由当归、丹参、红花、桂枝、桑寄生、地龙、杜仲、枸杞、苍术、细辛等10多味药物组成，全方以活血通络为主，又兼祛风除湿、补益肝肾之功。经临床应用表明骨痹合剂疗效确切[19]。但其具体作用机制目前尚未明确，故需要进一步深入研究，在本次研究中，以KOA模型小鼠为实验研究对象，以具有活血通络作用的骨痹合剂对KOA模型小鼠灌胃，通过以方测法，来探究基于PI3K/Akt信号传导途径活血通络法防治KOA的分子机制。

4.2 KOA与PI3K/Akt信号通路的关系 KOA是一种渐进性关节软骨退变疾病，其病理特征为关节软骨退变，以膝关节变性、骨糜烂、滑膜炎为主要病理进程。好发于中老年人，是骨伤科的常见病、难治疾病之一。关节软骨退行性改变是KOA的主要病理特征，软骨细胞凋亡是KOA发病的重要原因[20-22]。细胞凋亡增加，会导致软骨基质降解，基质合成减少[23]，通过有效抑制软骨细胞凋亡从而防治KOA的产生和发展。PI3K/Akt信号通路有“抗凋亡途径”之称，被认为是软骨细胞存活的首要通路，能将信号由细胞膜快速传到到细胞核，参与多种细胞增殖、分化调节和凋亡的过程，并且可以有效地调控软骨细胞增殖、凋亡以及基质重塑，其下游Bad、Caspase和NF-κB为重要的促膝骨关节软骨凋亡因子[24]。Bad是Bcl-2家族成员之一，未磷酸化Bad与Bcl-2家族成员形成同源二聚体，提高线粒体通透性，细胞色素C释放，Caspases连锁反应激活，故而细胞发生凋亡[25]。Caspase家族在细胞凋亡过程中扮演重要角色，有两类分子发生作用：其一是起始Caspases因子（例如Caspase-2，8和9），在接收胞质上游凋亡信号刺激后激活下游Caspase分子活化。Caspase-9可联系凋亡内外源，并级联激活Caspase家族因子扩大凋亡信号；其二是效应Caspases因子（例如Caspase-3，6等），当效应因子被激活并逐级活化后，特异性水解一系列蛋白质底物，从而诱发细胞发生凋亡。Caspase-3被称为“死亡蛋白酶”，因为激活的Caspase-3引起下游的凋亡反应，从而促使细胞发生凋亡，Caspase-3的活化预示细胞凋亡执行阶段[26]。由此推断，可以通过介入PI3K/Akt途径降低Caspase-3、Caspase-9的活性，达到减轻KOA损伤所致的细胞凋亡的目的。NF-κB参加多种生物学过程，是广泛存在于真核细胞的多向性转录因子，有着调节多种细胞因子、生化因子及酶等基因表达的作用[27]。激活的NF-kB调节了一系列诱导ECM破坏的细胞因子的表达，加剧了KOA的过程[28]。故有效抑制NF-kB通路也许是治疗KOA的潜在方向。综上所述，PI3K磷酸化活化后激活下游Akt，活化的Akt能有效降低Bad蛋白、Caspase-3蛋白等凋亡前蛋白从而起到抑制细胞凋亡的作用[29]。

Hulth法是诱导KOA模型的的经典方法。此方采用切除内侧半月板及前交叉韧带，手术创伤小，成功率高，可成功建立KOA模型。在本次实验中，生理盐水组出现软骨表面可见缺损且软骨细胞数量明显减少，软骨表面粗糙，表明KOA模型制备成功；骨痹合剂组小鼠的软骨组织较生理盐水组有明显改善，软骨表面细微裂隙减少，软骨细胞数目增加。表明骨痹合剂具有修复关节软骨的作用。免疫组化蛋白检测中可见骨痹合剂组软骨组织中Bad蛋白、Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白、NF-κB蛋白表达下调；PCR检测中可见骨痹合剂组 Bad、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB mRNA表达下调，与生理盐水组比较均有统计学意义。由此推断骨痹合剂能调控KOA小鼠软骨细胞PI3K/Akt信号通路，降低 Bad、Caspase-3、Caspase-9以及NF-κB蛋白和基因表达。从而抑制促凋亡蛋白，促进细胞存活以达到防治KOA的效果。综上所述，基于活血通络法的骨痹合剂通过调控PI3K/Akt通路下调促凋亡蛋白Bad、Caspase-3、Caspase-9以及NF-κB蛋白和基因表达从而促进细胞存活，减轻KOA损伤而导致的细胞凋亡，延缓KOA病程进展。