基于数据挖掘和网络药理学探讨中医药治疗急性胰腺炎的用药规律及潜在机制*

李 军，王 淼，王 林，左俊岭，朱章志△

（1.广州中医药大学，广东 广州 510000；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是消化系统常见的危急重症。据统计，全球急性胰腺炎的发病率为33.74例/（10万人·年）（95%CI 23.33-48.81），死亡率为1.60例/（10万人·年）（95%CI 0.85-1.58）[1]，并且有21%的患者在第一次急性胰腺炎发作后会发展为复发性急性胰腺炎[2]。急性胰腺炎是胰酶在胰管内被激活引起胰腺的局部或全身炎症，治疗上多予禁食、抑酶、液体复苏、维持器官功能及抗感染等[3]。

中医并无急性胰腺炎的病名，根据其发病特点，可归属于“脾心痛”“腹痛”“胃心痛”等范畴。近年来，中医在急性胰腺炎的治疗上积累了丰富的经验，先后发布了《急性胰腺炎中医诊疗专家共识意见（2017）》《消化系统常见病急性胰腺炎中医诊疗指南（基层医生版）》。指南共识指出“腑气不通”是急性胰腺炎的基本病机，而重症急性胰腺炎的关键病机是“瘀毒内蕴”，并提出“通里攻下”是急性胰腺炎的治疗原则。根据证型的不同，临床可选用大柴胡汤、大承气汤、小承气汤、大黄牡丹汤、柴胡疏肝散等治疗[4-5]。

结合岭南地区的气候特点、人群体质特征，广州中医药大学第一附属医院在临床运用中医药治疗急性胰腺炎方面积累了丰富的经验。

1 材料和方法

1.1 中药处方的收集 收集2020年1月1日至2020年12月31日在广州中医药大学第一附属医院住院且第一诊断为“急性胰腺炎”的患者中药处方。

1.1.1 纳入标准 ①患者出院的第一诊断为急性胰腺炎，符合急性胰腺炎的诊断标准：a.急性、突发、持续、剧烈的上腹部疼痛，可向背部放射；b.血清淀粉酶和/或脂肪酶活性至少高于正常上限值3倍；c.增强CT/MRI呈AP典型影像学改变（胰腺水肿或胰周渗出积液）。临床上符合上述3项标准中的2项，即可诊断为AP[3]；②住院期间接受中药汤剂治疗，具有完整的中药处方；③年龄≥18周岁。

1.1.2 排除标准 ①患者住院期间合并有其他急性或严重循环、呼吸、神经、免疫等系统疾病，如：急性心力衰竭、急性心肌梗死、急性脑血管意外、恶性肿瘤等；②急性胰腺炎患者接受外科手术治疗者；③妊娠或哺乳期女性患者。

1.2 运用古今医案云平台分析 将中药处方进行筛选并录入Microsoft Excel 2016，并建立处方表格数据库。根据《中华人民共和国药典2020版》将中药名称标准化，如麸炒白术统一为白术，北柴胡统一为柴胡。再将处方数据库导入古今医案云平台（http：//www.yiankb.com），由两名研究者进行数据处理，其中一名负责将处方录入古今医案云平台，另一名研究者对录入信息进行校正。最后利用古今医案云平台进行用药频次统计、关联规则分析及聚类分析。

1.3 药对化学成分及靶点检索 通过TCSMP数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php/）获取核心药对的活性成分及靶点信息[6]。使用 Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）将药物的靶点名称进行矫正统一[7]。

1.4 急性胰腺炎疾病相关靶点检索 以“Acute pancreatitis”为关键词检索以下数据库：OMIM（https：//omim.org/）、Drugbank（https：//go.drugbank.com/）、Gene Card（https：//www.genecards.org/），得到疾病相关靶点[8-10]，将所有靶点合并，剔除重复项。

1.5 交集靶点获取及药对-成分-交集靶点网络构建利用Venn在线平台（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）获取药对与疾病交集靶点[11]，运用Cytoscape 3.8.0软件构建药对-成分-交集靶点网络图。

1.6 交集靶点PPI网络构建 将交集靶点导入STRING 数据库（https：//string-db.org/），选择物种为Homo sapiens，minimum required interaction score ＞0.7，构建PPI网络并保存结果[12]。将结果文件导入Cytoscape 3.8.0软件，并通过Degree值获取网络中排名靠前的核心基因。

1.7 GO及KEGG通路富集分析 通过 David（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）数据库对于药对-疾病交集靶点进行GO及KEGG功能通路富集[13]，并对富集结果进行可视化呈现。

2 结果

2.1 中药处方及药物频次 经过检索共获取中药处方238首，共涉及中药164味，总频次为2 946次，其中柴胡出现的频次最高，为186次，其次为黄芩167次、法半夏161次，频次＞50次的药物有16味。见表1。

表1 高频药物频数表（频数＞50）

2.2 关联规则分析及核心药对获取 使用古今医案云平台中的关联规则算法进行关联规则分析，设定支持度>0.4，置信度>0.5，最大前项数为2。得出治疗急性胰腺炎药对组合的关联规则，见表2。其中，置信度最高的且关联性强的药对是大黄-黄芩-柴胡，置信度为 97.58%，支持度为 50.84%，是我院临床治疗急性胰腺炎的核心药对。

表2 药物关联规则结果

2.3 聚类分析 将频次＞60的15味中药进行欧式、最长距离聚类分析，以横向聚类图展示，见图1。结果表明，根据欧式距离11可将高频药物分为5类。第1类：厚朴、丹参、赤芍；第2类：茯苓、白术、甘草、枳壳；第3类：延胡索；第4类：法半夏、枳实、生姜；第5类：白芍、大黄、柴胡、黄芩。

图1 药物聚类分析树状图

2.4 柴胡-黄芩-大黄活性成分及靶点筛选 在TCMSP数据库中设定OB≥30%、DL≥0.18，筛选得到柴胡活性成分12种，对应靶点157个，黄芩活性成分32种，对应靶点90个，大黄活性成分7种，对应靶点49个，删除重复成分及靶点后共得到49种活性成分和185个靶点。

2.5 急性胰腺炎相关靶点 以“Acute pancreatitis”为关键词分别检索 OMIM、GeneCards（取 score＞15）、DrugBank数据库，去除重复后共得到576个急性胰腺炎相关基因。

2.6 交集靶点获取及药对-成分-交集靶点网络构建将药对柴胡-黄芩-大黄与急性胰腺炎的靶点分别输入Venn在线平台，共获得交集靶点71个，对应柴胡活性成分11种；大黄活性成分6种；黄芩活性成分29种，去除重复后剩余44种活性成分。利用Cytoscape 3.8.0软件构建药对-成分-交集靶点网络图。见图2。

图2 药对-成分-交集靶点网络图

2.7 交集靶点PPI网络构建，获取核心靶点 将交集靶点导入STRING数据库，获取蛋白相互作用关系，将结果导入Cytoscape 3.8.0软件绘制蛋白互作网络PPI图（见图3）。图中方形节点表示靶点，连线表示靶点之间相关联，共有71个节点，254条连线。根据Degree值对PPI网络中靶点进行排序，得到排名前 10 的核心基因为：AKT1、TNF、TP53、IL-6、JUN、MAPK1、MAPK8、VEGFA、EGF、MMP9。

图3 蛋白互作网络图（PPI）及核心靶点PPI网络图

2.8 GO及KEGG功能通路富集分析 将71个交集靶点输入David数据库进行GO及KEGG功能通路富集分析。GO通路富集分析包括biological process（BP，生物过程）、cellular component（CC，细胞组分）和molecular function（MF，分子功能）3个生物学过程。设置P<0.05，对排名前15个通路进行可视化处理。生物过程主要涉及凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process，23个靶点），RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter，27 个靶点），对药物的反应（response to drug，17个靶点）等，见图4；细胞组分主要涉及细胞外间隙（extracellular space，29个靶点），细胞外组分（extracellular region，24个靶点），细胞浆（cytosol，32个靶点）等，见图 5；分子功能主要涉及相同蛋白质结合（identical protein binding，25个靶点），酶结合（enzyme binding，17个靶点），蛋白质异二聚活性（protein heterodimerization activity，18个靶点）等，见图 6。

图4 BP富集分析结果图

图5 CC富集分析结果图

图6 MF富集分析结果图

KEGG富集通路结果根据其Count值得出排名前15的通路（图7）。主要涉及PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway，23个靶点）；肿瘤坏死因子信号通路（hsa04668：TNF signaling pathway，19个靶点）；丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路（hsa04010：MAPK signaling pathway，18个靶点）等。

图7 KEGG富集分析结果图

3 讨论

中医古籍并无急性胰腺炎的治疗记载，根据临床观察、辨证论治，认为急性胰腺炎的基础病机是腑气不通，缘于食积、气滞、酒毒、血瘀等病理因素导致机体气机不畅，脾胃运化失司，痰湿内蕴，郁久化热，久则血瘀、浊毒渐生，有形邪实阻滞中焦，从而导致“腑气不通，不通则痛”[4-5]。《内经》云：“热气留于小肠，肠中痛，瘅热焦渴，则坚干不得出，故痛而闭不通矣”[14]，指出了气滞郁热导致腹痛的病因病机。本文通过对2020年在广州中医药大学第一附属医院住院患者的处方进行数据挖掘，得出临床上治疗急性胰腺炎的高频药物是柴胡、黄芩、法半夏等，并根据关联规则分析得出支持度与置信度最高的核心药对为柴胡-黄芩-大黄。柴胡味辛、苦，归肝、胆经，《神农本草经》中记载柴胡“主心腹，去肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新”[15]。柴胡不仅可以疏肝解郁，也可疏解胃肠气滞，通腹泄浊。现代药理研究表明，柴胡具有促进胰酶分泌的功能，可减轻因胰酶分泌受阻导致的胰腺自我消化[16]。柴胡的主要成分柴胡皂苷可以促进内源性糖皮质激素的分泌，减轻全身炎症反应[17]。黄芩味苦性寒，《别录》中记载：“（黄芩）疗痰热胃中热，小腹绞痛，消谷，利小肠”[18]。黄芩入胆经可清少阳邪热；入脾、大肠经则燥肠胃湿热，通利肠腑，为清热泻火、燥湿解毒之要。大黄别名将军，味苦性寒，《本经》曰：“（大黄）破症瘕积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷”[15]。临床上，大黄是治疗实热便秘、积滞腹痛、泻痢不爽、湿热黄疸的常用药。柴胡-黄芩-大黄三药配伍，有行气通腹，清热解毒之功，在急性胰腺炎的治疗上发挥着相辅相成的作用。最后，聚类分析将高频药物分为5类，其中第5类（白芍、大黄、柴胡、黄芩）包含核心药对，从另一方面验证了柴胡-黄芩-大黄药对在治疗急性胰腺炎中的关键作用。

急性胰腺炎的发病机制是胰腺内的消化酶被激活，引起胰实质及胰周组织的自我消化，又进一步促使各种有害物质释放，从而引起全身炎症反应综合征（SIRS），造成呼吸、循环、内分泌等多系统损害[19]。本研究通过检索TCMSP数据库得到柴胡-黄芩-大黄药对的活性成分，包括黄芩苷（Baicalin，MOL002776）、大黄素（Emodin，MOL002288）等成分。现代药理研究大黄素能够通过抑制P2X7/NLRP3通路显著减轻胰腺组织和腺泡细胞的结构损伤，并能显著下调血浆淀粉酶和脂肪酶水平以及胰腺组织MPO活性[20]。大黄素能抑制重症胰腺炎大鼠中性粒细胞的迟发性凋亡，防止全身炎症反应综合征的发生[21]。另一项动物实验表明，大黄素与黄芩苷连用可以通过上调或下调相关基因的表达，减少体内氧化应激反应，对AP模型大鼠有益[22]。根据Degree值得出核心靶点包括 AKT1、TNF、IL-6、MAPK1、MAPK8 等。IL-6（白介素-6）、TNF（肿瘤坏死因子）是体内重要的炎症因子，参与炎症反应的调控，在局部炎症反应及全身炎症反应中都有很高的表达。一项研究表明，在急性胰腺炎早期，IL-6的值可以用来预测重症胰腺炎，临界值为196.6 pg/mL（敏感性81.9%，特异性91.3%）[23]。此外，大黄能显著增加胰腺组织的血流灌注，逆转线粒体损伤，促进胰腺腺泡和星状细胞增殖，大黄酸通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路和抑制AMPK活性，在胰腺组织中有较高的分布，对AR42J细胞线粒体有保护作用[24]。GO富集结果表明，柴胡-黄芩-大黄药对治疗AP主要与负调控凋亡过程、正调控RNA聚合酶启动子的转录及药物反应有关，这些靶点存在于细胞外间隙、组分及细胞浆，通过干预蛋白质的结合、酶的结合等分子活动。KEGG结果表明，PI3KAkt、TNF、MAPK等信号通路是柴胡-黄芩-大黄药对干预AP的主要通路。IL-17等促炎因子能够快速磷酸化MAPK激活 NF-κB进行转录，诱导炎症级联反应，可加重全身炎症的反应[25]，而抑制MAPK/NF-κB通路则对重症胰腺炎大鼠的急性肺损伤具有保护作用[26]。此外，上调胰腺炎模型大鼠胰腺组织中PI3K和p-Akt的表达，可以减少胰腺细胞凋亡[27]。

中医治疗急性胰腺炎在临床上取得了一定的疗效和认可，中药内服、外敷以及灌肠治疗应用普遍。本文通过数据挖掘与网络药理学浅谈中医药治疗急性胰腺炎的理论基础与潜在机制，提出了柴胡-黄芩-大黄药对通过多靶点、多通路治疗急性胰腺炎的机制。但数据挖掘及网络药理学的分析方法还有不足，需要进一步的实验及临床验证。