p53、p63和Ki67与肌层浸润性膀胱癌预后的关系

潘麒，蒋立人 ，陈思腾，高峰

（1上海市第一人民医院泌尿外科；2上海市第一人民医院病理科，上海200080）

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，居我国所有男性恶性肿瘤的第7位[1]。膀胱癌可以分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer, MIBC）。根治性全膀胱切除术和基于顺铂药物的辅助化疗是MIBC的标准治疗方案[2,3]。顺铂的作用方式是通过与DNA相互作用，激活多种信号转导途径，并最终激活细胞凋亡[4]。然而，仍有约一半的MIBC患者在标准方案治疗后仍会出现肿瘤复发[2,3]。目前，对于全膀胱癌术后的辅助化疗是否有疗效存在一定的争议[5]。

目前已知多于80%的p53突变是发生在DNA绑定区，突变的p53与肿瘤成长有密切的关联[6,7]。p63目前尚未发现突变型，其结构相较于p53要稳定的多[8]。现已知p63的异型结构是N端截短p63（N-terminal truncated p63, ΔNp63）[6]。野生型p53和p63是重要的抑癌基因，其主要受到癌基因MDM2和MDMX的调控[6]。突变型p53和ΔNp63能竞争性拮抗并抑制野生型p53和p63[7]。目前已知突变型p53是尿路上皮性膀胱癌常见的致癌基因[9]。研究发现突变型p53在MIBC中过度表达，可作为膀胱尿路上皮癌进展的标志之一[2]。另外p63的表达对于尿路上皮癌和鳞状细胞癌进展亦有相关性[9,10]。

Ki67是独立的预后因素，其阳性的恶性细胞比例与肿瘤进展以及患者预后相关[11,12]。已有研究提示Ki67和膀胱癌预后存在相关性，高Ki67指数提示膀胱癌不良预后[13~15]。

资料与方法

1 临床资料

回顾性收集2007年1月至2016年12月在上海第一人民医院行根治性全膀胱切除术+尿流改道术患者99例。所有患者均为术后病理诊断为T2~4N0M0、 既往无其他肿瘤病史和除术后辅助化疗外未接受其他放化疗。

2 免疫组织化学染色

送检标本均由福尔马林充分固定并脱水及石蜡包埋。先苏木素-伊红（HE）染色，后另行EnVision法免疫组织化学标记对突变型p53、p63和Ki67，所有免疫组织化学染色均设阴性、阳性对照。HE染色试剂以及免疫组织化学抗体突变型p53、p63和Ki67均购于福州迈新生物技术开发有限公司。所有HE及免疫组织化学切片均由在Olympus BX600显微镜下观察并采集图像。

3 结果判读

本研究先阅览HE切片明确为MIBC诊断，随后由2位病理科医师对免疫组织化学染色结果进行独立判读。本研究免疫组织化学判读的突变型p53、p63和Ki67 阳性为细胞核着色，胞浆和胞膜着色不计入阳性表达。

4 统计学方法

应用SPSS软件，进行t检验、卡方检验对两组间的因素进行比较分析；采用Kaplan Meier分析各临床病理因素对总生存（overall survival, OS）和无病生存（disease-free survival, DFS）概率的影响，生存曲线的显著性差异检验用log-rank检验。单因素生存分析年龄、性别、分期、突变型p53、p63、Ki67和辅助化疗。用COX回归模型（逐步向前）进行多因素回归分析，计算出调整过的hazard ratio（HR），评估影响OS概率和DFS概率的预后因素。双侧P＜0.05作为显著性检验水准。

结 果

1 突变型p53和p63以及Ki67的表达和MIBC患者预后的关系

突变型p53和p63的免疫反应阳性表达定位在膀胱尿路上皮癌的肿瘤细胞核（图1A—D）。在68例突变型p53免疫反应阳性MIBC患者和31例突变型p53阴性患者中，患者男女性别分布、pT分期、p63表达、Ki67≥30%阳性表达、5年OS概率和DFS概率的平均值（图2A）的差异均没有显著性。在73例p63免疫反应阳性的MIBC患者和26例p63阴性的患者中，男女性别分布、pT分期、p63的表达和Ki67表达、p63阳性患者的5年OS和DFS平均值与p63阴性的患者5年OS和DFS平均值之间（图2B）无显著的统计学差异。Ki67阳性表达30%为界的分组提示（图1E、F），66例Ki67≥30%阳性的患者和33例Ki67< 30%阳性的患者中，患者男女性别分布没有显著的统计学差异，但Ki67≥30%阳性和Ki67< 30%阳性的患者之间的pT分期有显著的统计学差异（P=0.010）。Ki67≥30%阳性患者的5年OS概率和DFS概率与Ki67< 30%阳性患者的5年OS和DFS之间没有显著的统计学差异（图2C）。综合pT分期、患者年龄和患者接受术后辅助化疗的情况，分别与突变型p53、p63和Ki67并不能作为MIBC患者预后的独立危险因素（表1）。

表1 综合多因素分析Tab.1 Multiple Cox regression analysis upon different biomarkers

图1 EnVision法免疫组织化学染色检测突变型p53、p63和Ki67在MIBC组织中的表达。A，突变型p53阳性表达；B，突变型p53阴性表达；C，p63阳性表达；D，p63阴性表达；E，Ki67阳性≥30%；F，Ki67阳性<30%；比例尺，200μmFig.1 Immunohistochemical staining for the expression of mutant p53, p63 and Ki67 in MIBC tissues. A, mutant p53 positive; B, mutant p53 negative;C, p63 positive; D, p63 negative; E, Ki67 positive rate more than 30%; F, Ki67 positive rate less than 30%; scale bar, 200μm.

2 突变型p53、p63和Ki67综合表达与pT的关系

基于突变型p53、p63和Ki67的表达均不能作为MIBC患者的预后提示标记物，我们综合突变型p53、p63和Ki67表达，提出了综合判读指标。在33例突变型p53、p63和Ki67阳性≥30%均阳性的综合阳性（comprehensive positive）组患者和66例突变型p53、p63、Ki67阳性≥30%非均阳性（至少一个指标阴性）的综合阴性（comprehensive negative）组患者中，阳性组患者的5年OS和DFS显著差于阴性组的患者（P=0.024，P=0.009）（表2，图2D）。另外，综合pT分期、患者年龄和患者术后辅助化疗情况以及突变型p53阳性/p63阳性/Ki67阳性≥30%的多因素分析，我们发现突变型p53阳性/p63阳性/Ki67阳性≥30%是MIBC患者预后的独立危险因素（表3）。

表2 突变型p53、p63和Ki67阳性综合表达与MIBC临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between the comprehensive expression of mutant p53, p63, Ki67 and the clinicopathological characteristics of MIBC patients

表3 突变型p53、p63和Ki67阳性综合表达的多因素分析Tab.3 Multiple Cox regression analysis of the comprehensive expression of mutant p53, p63 and Ki67

图2 突变p53、p63和Ki67阳性≥30%表达与DFS概率关系分析。A，突变型p53表达；B，p63表达；C，Ki67阳性≥30%表达；D，综合表达Fig. 2 Analysis for the relationship of the expression level of mutant p53, p63 and Ki67 with the DFS of MIBC patients. A, mutant p53 expression; B,p63 expression; C, Ki67 expression; D, comprehensive expression

3 突变型p53、p63和Ki67阳性的综合表达与术后辅助化疗预后的关系

术后辅助化疗对于MIBC患者的作用一直存在争议，在本次研究的99例MIBC患者中发现55例患者在术后接受了辅助化疗。接受术后化疗的MIBC患者5年OS概率和DFS概率没有显著优于未接受术后化疗的患者（图3A、B），但发现综合阳性组患者其化疗后5年OS概率和DFS概率显著提高，而综合阴性组患者的化疗后5年OS率和DFS率反而略有下降（图3C、D）。

图3 突变型p53、p63和Ki67阳性的综合表达对辅助化疗预后的影响。A，辅助化疗OS概率；B， 辅助化疗DFS概率；C，突变型p53、p63、Ki67阳性综合表达辅助化疗OS概率；D， 突变型p53、p63、Ki67阳性综合表达辅助化疗DFS概率Fig. 3 Effect of the comprehensive positive expression of mutant p53, p63 and Ki67 on the prognosis of patients with adjuvant chemotherapy. A. OS of patients with adjuvant chemotherapy; B, DFS of patients with adjuvant chemotherapy; C, effect of the comprehensive positive expression of mutant p53, p63 and Ki67 on the OS of patients with adjuvant chemotherapy; D, effect of the comprehensive positive expression of mutant p53, p63 and Ki67 on the DFS of patients with adjuvant chemotherapy

讨 论

本研究主要发现突变型p53、p63和Ki67的综合运用对于MIBC患者的预后有提示作用，同时该综合运用对于术后辅助化疗的疗效判断有一定的指导作用，可以为MIBC患者的术后辅助化疗提供参考。

首先通过对临床病理膀胱尿路上皮癌常用的免疫组织化学标记物突变型p53和p63的分析。突变型p53是顺铂的作用靶点[4]。顺铂的凋亡活性需要通过产生活性氧来启动p53介导的通路[16]。同时，顺铂能恢复p53功能，增强患者对放疗的敏感性[16]。另外，p53还能与顺铂损伤的DNA分子相互作用从而对肿瘤细胞产生杀伤作用[16~18]。我们没有发现突变型p53和p63对于MIBC患者的预后有明确的参考作用。同时，研究未发现单独的突变型p53和p63的表达情况对于MIBC患者术后辅助化疗的疗效上有显著的统计学差异。

Ki67也是一种临床上常用的诊断MIBC的辅助标记物，其高表达提示细胞的高增殖，也进一步提示肿瘤细胞的增殖和生长情况[19]。然而，COX回归生存分析没有提示Ki67高表达和MIBC患者预后不佳有关。不过Ki67的高表达和pT分期存在显著的统计学差异。同时，Ki67大于等于30%阳性的患者，其术后接受辅助化疗的5年OS和DFS没有显著的统计学差异。

因此，我们需要一种综合标记物，既能提示患者预后，也能提示患者术后化疗有效性的标记物。因此，在综合常用MIBC免疫组化诊断标记物的基础上，本研究提出综合突变型p53和p63均阳性且Ki67阳性表达≥30%为MIBC预后和术后辅助化疗的新指标。该指标不仅可以提示MIBC患者的5年OS和DFS，并且可以为MIBC患者术后辅助化疗疗效的提供预测，可以减少不必要的过度治疗，并提高患者生存率。同时，由于是常用免疫组织化学诊断标记物，可以节省患者不必要的额外支出，在经济和实用的同时为临床MIBC的治疗提供行之有效的指标。

综上，本次研究综合临床MIBC常用的免疫标记物突变型p53、p63和Ki67的表达和临床指标的综合分析，发现综合运用突变型p53、p63和Ki67的指标预测MIBC患者的OS和DFS，并且为MIBC患者的术后辅助化疗提供预测。